I.F. Pryme, S. Bardocz, A. Pusztai and S.W.B. Ewen

 

REZUMAT

S-a arătat că limfomul non-Hodgkin murin (NHL) este redus prin adăugarea lectinelor ML-I în dietă. Caracteristicile morfologice ale tumorilor NHL în cazul cobailor hrăniți cu diete ce conțin lectină din vâsc (ML-I) sunt diferite de acelea ale cobailor din grupul de control. Gradul activității mitotice a fost mai scăzut și zona nucleară a fost mai redusă. Gradul infiltrării limfocitare a fost crescut în cazul tumorilor de la cobaii hrăniți cu ML-I și acesta a fost însoțit de o incidență crescută a corpurilor apoptotice. Observația vizuală a tumorilor NHL din cazul indivizilor hrăniți cu o dietă ce conține ML-I a evidențiat o vascularizație slabă în contrast cu situația cobailor din grupul de control, cărora li s-a administrat hrană normală. O reducere majoră a numărului de capilare sanguine în cazul tumorilor NHL a fost confirmată prin evaluarea microscopică a secțiunilor tumorale. Rezultatele au sugerat existența unui răspuns anti-angiogenic în cazul cobailor cărora li s-a administrat ML-I. Astfel, administrarea ML-I, comparativ cu dieta de control, a condus la mai multe schimbări identificabile în morfologia tumorilor NHL, schimbări aflate în concordanță cu observarea reducerii masei tumorale. În 25% dintre cobaii hrăniți cu ML-I timp de 11 zile, nu s-a mai observat nicio evidență histologică a tumorii viabile. Studiile morfologice ale intestinului subțire au indicat că (a) lectina induce hiperplazia și că (b) lectina se leagă cu aviditate de țesutul limfoid al plăcilor Peyer. S-a evidențiat endocitoza limitată a lectinei. Un experiment unde ML-3 a fost adăugată în dieta cobailor la trei zile după inocularea celulelor tumorale a arătat că lectina a fost capabilă să încetinească creșterea tumorii. Rezultatele arată că lectinele ML din vâsc induc efecte puternice anticancer atunci când sunt administrate pe cale orală.

 

Introducere

Folosirea extractelor din vâsc în terapia pacienților bolnavi de cancer are o istorie de mai bine de 80 de ani. Datorită documentației sărăcăcioase de până acum asupra naturii și caracterizării componentelor anticancerigene active din vâsc, utilizarea acestor extracte din vâsc în terapia pacienților bolnavi de cancer a fost mult criticată. O problemă majoră este faptul că diferitele extracte de pe piață sunt preparate prin diferite procedee și, astfel, există o lipsă a standardizării. În plus, se pare că efectele extractelor din vâsc sunt în legătură cu tipul de copac gazdă și, un lucru important, s-a arătat că compoziția diferiților componenți prezenți în extracte variază destul de mult, adesea ca o consecință a variațiilor climatice sezoniere. Această variație a compoziției extractelor din vâsc a fost evidențiată clar de Elsasser-Beile și ceilalți (1998), care au comparat efectele biologice a 12 preparate diferite din vâsc administrate clinic. Cercetătorii au stabilit că atât apoptoza, cât și producția de citokine a fost indusă diferit în culturile de leucocite de către variatele preparate din vâsc testate. Aceste rezultate indică, așadar, că studiile clinice realizate utilizând diferite preparate din vâsc nu sunt ușor de comparat. Extractele din vâsc au fost folosite foarte mult în circumstanțe în care toate celelalte metode de tratament au eșuat. Așadar, nu este surprinzător că rata succeselor documentate cu extracte din vasc nu este chiar atât de mare.

 

Astfel, datorită lipsei de conformitate între extractele individuale din vâsc și datorită complexității lor înnăscute, s-a ajuns la concluzia că este important să fie realizate studii folosind componente extrase și purificate din vâsc. Acest referat prezintă folosirea recentă a lectinelor din vâsc ca suplimente alimentare în cazul unui model tumoral animal.

 

Eifler și ceilalți (1993) au dezvoltat o procedură pentru purificarea lectinelor din planta uscată de vâsc. Astfel, au fost identificate trei lectine majore din vasc: ML-1, ML-2 și ML-3. Dintre acestea trei, lectina cea mai bine studiată este ML-1, care s-a dovedit a fi o RIP de tipul 2 (proteina inactivatoare a ribozomului). Această proteină este compusă din două lanțuri, un lanț A, care este caracterizat de activitatea N-glicozidazei (care conferă proprietatea de inactivare a ribozomilor), și un lanț B, ce posedă proprietăți de legare specifice galactozei. Lanțul B este responsabil pentru legarea de receptorii de la suprafața celulelor și, ulterior, permite pătrunderea la nivelul celulei a lanțului A, care își exercită proprietățile citotoxice. Studiile recente efectuate de Vervecken și ceilalți (2000) au arătat că lanțurile individuale A și B, luate separat, nu posedă proprietăți citotoxice. Vâscul este considerat, în general, extrem de toxic. Totuși, un studiu recent asupra efectelor rezultate în urma ingerării accidentale a plantei în 1754 de cazuri a arătat că nu există nicio dovadă asupra toxicității profunde a vâscului asupra omului (Krenzelok și ceilalți, 1997). Așadar, este evident că vâscul are o reputație cu totul nefondată și nemeritată de a fi considerat toxic prin administrarea pe cale orală. Din contră, după administrarea de ML-I purificată unor șobolani aflați în creștere, s-a arătat că lectina prezintă efecte de stimulare a creșterii, mai degrabă decât efecte de inhibare asupra celulelor criptelor din intestinul subțire (Pusztai și ceilalți, 1998).

 

Este bine cunoscut faptul că lectinele din vâsc au abilitatea de a iniția un răspuns imunomodulator (Hajto și ceilalți, 1989). S-a observat că un extract apos din vâsc provoacă o proliferare inițială puternică a celulelor sanguine periferice mononucleare după administrarea la adulții sănătoși (Stein și Berg, 1998; Stein și ceilalți, 1998). Aceasta a fost însoțită de o creștere a producției de TNF alfa și IL-6 și de o eliberare mai puțin pronunțată de IFN gamma și IL-4. Heiny și ceilalți (1998) și Baxevanis și ceilalți (1998) au raportat independent unii de ceilalți o activitate sporită a celulelor periferice sanguine naturale ucigașe (NK) că răspuns la administrarea lectinei din vâsc. De asemenea, s-au observat niveluri plasmatice crescute de beta-endorfină și stimularea limfocitelor T, prezentând expresia receptorilor CD25/interleukină-2 și a HLA/DR-antigeni (Heiny și ceilalți, 1998). Baxevanis și ceilalți (1998) au demonstrat că ML-I a stimulat preferențial și a crescut o populație de celule T CD8₊ care au mediat efectul citotoxic. În plus, o activare a PBL cu ML-I și IL-2 a condus la apariția celulelor NK T și CD56₊ și a citotoxicității LAK (ucigașa activată de limfokină). Schink (1997) afirmă că ML izolată induce creșterea atât a numărului, cât și a activității NK în sângele periferic într-o manieră dependentă de doză. Imunofenotiparea mostrelor de sânge prelevate de la pacienții tratați cu lectină a relevat un număr crescut de NK, activitate crescută a macrofagelor peritoneale și a celulelor NK, precum și un răspuns al celulelor splenice T față de mitogeni (Gabius și ceilalți, 1992). Recent, Bussing și ceilalți (1999) au analizat alterările de la nivelul mitocondriilor în cazul limfocitelor umane incubate cu ML-I. Cercetătorii au demonstrat generarea de intermediari reactivi ai oxigenului (ROI) și inducția expresiei unor proteine recent descrise ale membranei mitocondriale (Apo2.7). Astfel, răspunsul citotoxic apare în parte ca rezultat al unui „semnal distinct al morții” ce provoacă apariția rapidă a moleculelor Apo2.7.

 

Frantz și ceilalti (2000) au stabilit că glicoproteinele serice, în particular haptoglobina, dar, de asemenea, și glicoproteina acidă alfa 1 și transferina, inhibă efectiv proprietățile lectinelor ML de a induce apoptoza. Interesant este că haptoglobina deglicozilată nu exercită un asemenea efect protector. Aceste rezultate explică, probabil, de ce nu sunt observate efecte secundare nedorite atunci când pacienților le sunt administrate lectinele din vâsc.

 

În studiile lor asupra diferitelor linii de celule și limfocite umane, Bussing și ceilalți (1998) au raportat că ML-3 din Viscum album L. a mediat un semnal foarte puternic de moarte prin apoptoză, conducând la legarea Anexinei-V și la expresia proteinelor mitocondriale Apo2.7.

 

Ribereau-Gayon și ceilalți (1997) au demonstrat, de asemenea, inhibarea creșterii celulelor Molt 4, folosind concentrații de lectină în domeniul pg/ml. Cercetătorii au descoperit că ML-3 este de aproximativ 10 ori mai citotoxică decât ML-1. Evenimentele timpurii care s-au manifestat prin administrarea acestei lectine au fost perforația membranelor și protruzii, acestea fiind semne tipice ale apoptozei. Bantel și ceilalți (1999) au arătat, de asemenea, că tratamentul liniilor de celule leucemice T și B cu ML-1 a declanșat moartea celulară prin inducția apoptozei. Este interesant că un anumit inhibitor a fost capabil să blocheze aproape complet efectele observate ale lectinei. Se pare că ML-1 are capacitatea de a potența efectul medicamentelor chimioterapeutice.

 

Yoon și ceilalți (1999) au examinat proprietățile chimice și biologice ale lectinelor citotoxice (KML-C) izolate dintr-un extract de vâsc korean [Viscum album C. (coloratum)]. Proprietățile KML-C au fost comparate cu o lectină (EML-1) preparată din vâscul european [Viscum album L. (loranthaceae)]. Ambele lectine au prezentat o citotoxicitate puternică împotriva variatelor celule tumorale murine și de la om. Totuși, activitatea citotoxică a KML-C a fost mai mare decât cea a EML-1.

 

Yoon și ceilalți (1999) au arătat că activitatea KML-C de inducție a apoptozei a fost blocată de adăugarea de Zn²⁺, un inhibitor al endonucleazelor dependente de balanța Ca²⁺/Mg²⁺. Atât Pae și ceilalți (2000), cât și Lyu și ceilalți (2001) au demonstrat recent că incubarea celulelor HL-60 de leucemie la om cu variate doze de lectină din vâsc korean provoacă apariția evenimentelor apoptotice.

 

Park și ceilalți (2000) au arătat că lectina II din vâsc induce apoptoza într-o varietate de tipuri de celule, incluzând celulele T Jurkat, celulele RAW 264.7, celulele HL-60, celulele DLD-1 și celulele leucemiei mieloide acute. Interesant este că Pae și ceilalți (2000) au demonstrat că tratamentul simultan al celulelor HeLa de carcinom uman sau a celulelor MCF-7 de carcinom la sân cu lectine din vâsc izolate din vâscul european sau korean a făcut ca aceste celule maligne să fie mult mai sensibile la inducția apoptozei cu ajutorul lui TNF-alfa.

 

Într-o abordare diferită, Köteles și ceilalți (1998), folosind studii in vitro, au arătat că incubația limfocitelor de iepure slab iradiate cu raze X sau a celulelor de carcinom la plămâni (Calu1) cu ML-1 a facilitat un proces apoptotic la nivelul celulelor deteriorate mai degrabă decât la nivelul celulelor neafectate. Studiile in vivo asupra iepurilor iradiați cu raze X (1 Gy) au condus la aceleași efecte asupra celulelor deteriorate. Autorii au concluzionat că efectele combinate ale dozelor relativ scăzute de radiație ionizantă și ale lectinelor din vâsc, ML, se pare că sunt favorabile vindecării datorită efectului de baleiaj asupra celulelor somatice deteriorate.

 

Folosind modele experimentale la cobai, Yoon și ceilalți (1998) au studiat efectul profilactic al unei lectine din vâsc korean (Viscum album coloratum) (KM-110) asupra metastazelor tumorale produse de celule tumorale cu potențial metastatic ridicat (celule de carcinom la colon 26-M3.1, celule de melanom B16-BL6 și celule de limfom L5178Y-ML25). Acești cercetători au arătat că administrarea intravenoasă de KM-110 (100 mg/cobai) cu 2 zile înainte de inocularea tumorii a inhibat semnificativ metastazele la plămâni provocate de celulele B16-BL6 și de celulele de carcinom la colon 26-M3.1 și, de asemenea, a inhibat metastazele la ficat și la splină provocate de celulele L5178Y-ML25. În plus, cobaii cărora li s-a administrat KM-110 (100 mg) cu 2 zile înainte de inocularea celulelor tumorale au prezentat rate de supraviețuire semnificativ prelungite în comparație cu acei cobai care nu au primit lectină. Yoon și ceilalți (1998) au concluzionat că activitatea de imunopotențare a lectinei KM-110 întărește sistemul de apărare al gazdei împotriva tumorilor și, mai mult, că efectul său profilactic asupra metastazelor tumorale este mediat prin mecanismele de activare a celulelor NK.

 

Lectinele din vâsc

Efectele ML-1 asupra creșterii, intestinului subțire și metabolismului și formării corpului au fost studiate de Pusztai și ceilalți (1998) după ce au administrat timp de zece zile unor cobai diete care conțineau 67 sau 200 mg de ML-1/kcorp. Deși cobaii și-au redus voluntar aportul de hrană după adăugarea de ML-1 în dietă și, de asemenea, s-a observat o rată de creștere redusă, totuși, niciunul dintre cobai nu a scăzut în greutate în timpul perioadei experimentale. Digestibilitatea proteinelor sau a altor componente din dieta administrată nu a fost aparent afectată. La nivelul cel mai ridicat testat, ML-1 a crescut pierderile de azot prin urină, reducând astfel balanța globală de azot și conținutul total de azot din corp. Totuși, greutatea fecalelor și conținutul lor de azot nu au fost afectate. Nivelurile de insulină serică au fost reduse, așa cum s-a observat anterior, la folosirea PHA (Pusztai, 1991; Bardocz și ceilalți, 1996). Probabil că acesta a fost motivul pentru pierderea grăsimii din corp. Ca și în cazul PHA, ML-1 a indus, de asemenea, o hiperplazie a intestinului subțire dependentă de doză. La 30 de ore după administrarea unei diete conținând ML-1, s-a detectat o creștere semnificativă a TNF alfa și interleukina plasmatică 1 beta a fost, de asemenea, detectată în cantități ridicate. Astfel, eliberarea citokinelor, care este considerată a fi un pas esențial în imunomodulare, conducând la reducerea creșterii tumorale (Mannel și ceilalți, 1991), a fost promovată după administrarea pe cale orală a lectinei din vâsc. A fost raportată o legare avidă a ML-1 de celulele M ale plăcilor lui Peyer în intestinul subțire al cobailor (Pusztai și ceilalți, 1998). S-ar părea că acest lucru este în legătură cu creșterea nivelului de citokine, observată la nivelul plasmei. Deoarece nu s-a remarcat că o dietă conținând ML-1 ar avea efecte secundare nedorite, Pusztai și ceilalți (1998) au concluzionat că lectina ar trebui testată pentru proprietățile sale antitumorale în experimente pe animale.

 

Un avantaj major al administrării lectinelor din vasc pe cale orală este ca o mare parte din lectină, prin legarea ei de mucoasa intestinului subțire, ajunge la limfocitele plăcilor lui Peyer (celulele M) și, astfel, lectina poate induce un nivel crescut de citokine ca răspuns. În 24 de ore de administrare a ML-1 cobailor, s-a observat o reducere cu 14% a greutății splinei. Este posibil ca acesta să fie rezultatul unei eliberări masive de limfocite în circulația sanguină ca răspuns la nivelurile plasmatice crescute de citokine. Pare foarte improbabil ca un asemenea răspuns ar putea fi promovat de cantitățile mici de lectine care ar putea ajunge la țesutul limfatic atunci când extractele din vâsc sau lectinele sunt injectate subcutanat. De asemenea, este important de notat că activitatea NK este mult mai crescută la nivelul splinei decât, de exemplu, la nivelul ganglionilor limfatici. Deși majoritatea ML-1 (>95%) trece neschimbată prin intestinul subțire, totuși, mici cantități sunt preluate prin endocitoză și, în final, trec în circulația sanguină. S-a arătat că prezentarea orală a lectinei stimulează producerea anticorpilor serici specifici IgG și IgA după trei doze orale (Lavelle și ceilalți, 2000). În plus față de producerea de anticorpi împotriva ML, o altă complicație importantă rezultată în urma administrării ML pe cale sanguină este faptul că anumite glicoproteine serice (de exemplu, haptoglobina, glicoproteina acidă alfa (1) și transferina) inhibă proprietățile de inducție a apoptozei ale lectinelor ML in vitro (Frantz și ceilalți, 2000). Așadar, este incert cât de eficient își vor exercita lectinele proprietățile lor biologice, atunci când sunt administrate pe cale sanguină.

 

Pe baza efectelor semnificative ale PHA administrată pe cale orală în reducerea creșterii unui limfom transplantabil murin non-Hodgkin, s-au efectuat experimente similare folosind ML-1. Lectina a fost încorporată în diete semi-sintetice, ca în cazul administrării PHA (Pusztai și ceilalți, 1998). În experimente unde a fost testat un domeniu de concentrații ale lectinei (0,42-1,67 mg/g dietă), chiar și la concentrația cea mai scăzută de lectină testată, a fost remarcat un efect semnificativ asupra creșterii tumorale în sensul că masa tumorală s-a redus cu aproximativ 25%. La concentrația cea mai ridicată de ML-1, masa tumorală a fost redusă cu aproximativ 40% (Pryme și ceilalți, 1998). Rezultatele au indicat că reducerea creșterii tumorale a avut loc într-o manieră dependentă de doză. Observațiile au fost similare cu acelea anterioare din cazul unei tumori NHL crescând subcutanat în cobai NMRI hrăniți cu PHA în domeniul de concentrație 0,45-7 mg/g dietă (Pryme și ceilalți, 1996).

 

Tumoarea NHL din cazul cobailor din grupul de control sau al cobailor cărora li s-a administrat PHA are în mod caracteristic un sistem de capilare sanguine extrem de bine dezvoltat și, astfel, se prezintă extrem de bogată în sânge la disecție. Un fapt interesant este că tumorile NHL îndepărtate de la cobaii cărora li s-a administrat ML-1, pe lângă faptul că erau mai mici, erau mult mai puțin sângeroase la vedere, cu evidența macroscopică a unei vascularizații mai slab dezvoltate. Studiile morfologice ale secțiunilor tumorale au confirmat incidența redusă semnificativ a vascularizării tumorale (Ewen și ceilalți, 1999). Aceste rezultate sunt în acord cu observațiile inițiale cu ochiul liber asupra tumorilor NHL și sugerează că unul dintre răspunsurile la administrarea orală de ML-1 este declanșarea producerii de factori antiangiogenici. Aceste observații sunt în acord perfect cu rezultatele lui Yoon și ceilalți (1995); folosind un extract de vâsc korean în cazul unei serii de linii de celule tumorale murine, cercetătorii au sugerat că efectul antimetastatic al lectinei s-a datorat în parte unei inhibări a angiogenezei induse de către tumoare.

 

Stadii în efectele lectinelor din vâsc administrate în dietă asupra creșterii tumorale

Pe baza observațiilor făcute asupra modelelor animale și a datelor publicate, după administrarea pe cale orală a lectinelor din vâsc se sugerează ca au loc următoarele evenimente:

1. ML se leaga de celulele M din plăcile lui Peyer prin receptorii de galactoză/N-acetil glucozamină.

2. Stimularea producerii de citokine și eliberarea acestora: niveluri plasmatice crescute de citokine.

3. Activarea și eliberarea limfocitelor și macrofagelor splenice, activarea NK.

4. Infiltrarea tumorii de către limfocite, NK și macrofage.

5. Producerea și eliberarea factorilor antiangiogenici: reducerea vascularizării tumorale.

6. Reducerea disponibilității nutrienților pentru creșterea tumorii și scăderea aportului de oxigen.

7. Efectele citotoxice asupra celulelor tumorale.

8. Inducerea apoptozei.

9. Moartea celulelor tumorale.

Concluzii și perspective

Rezultatele extrem de promițătoare obținute prin folosirea lectinelor din vâsc administrate ca suplimente alimentare pentru a reduce creșterea unui limfom murin transplantabil non-Hodgkin sugerează oportunitatea pentru stabilirea unei forme noi de tratament pentru cancer. Din punctul de vedere al pacientului bolnav de cancer, ingestia pe cale orală a unui preparat pe bază de lectine, cu efecte secundare neglijabile, ar reprezenta o alternativă foarte preferată față de tratamentul convențional anticancer din zilele noastre (de exemplu, chimioterapie, radioterapie), care este asociat cu un disconfort sporit și cu traumatizări majore. S-ar părea că proprietățile ML de stimulare a criptelor ar putea fi folosite într-o manieră protectoare și sinergică în ceea ce privește efectele distrugătoare cunoscute ale chimioterapiei și ale radioterapiei asupra structurii criptelor intestinale. Astfel, se pare că ML ar fi un supliment alimentar perfect înainte, în timpul și după chimioterapie și/sau radioterapie. Sunt necesare cercetări ulterioare care să ofere o cunoaștere detaliată a mecanismelor reale din spatele efectelor rezultate prin administrarea pe cale orală a lectinelor din vâsc în calitate de agenți antimetastatici. Acum, după ce au fost izolate și purificate o serie de lectine din plante, sunt necesare studii ulterioare pe animale care să examineze potențialul antitumoral al acestor lectine prin administrarea lor în dietă.

 

 

p