Cunshan Zhou, Lichun Qian, Haile Ma, Xiaojie, Yu, Youzuo Zhang, Wenjuang Qu, Xiaoxu Zhang, Wei Xia

 

REZUMAT

A fost testată citoactivitatea amigdalinei în forma simplă și în forma activată cu beta-D-glucozidază în ceea ce privește inhibiția creșterii și inducția apoptozei în cazul celulelor HepG2. Testul MTT de viabilitate a celulelor a dovedit faptul că toate mostrele de amigdalină au avut efect asupra proliferării celulelor HepG2, proporțional cu doza administrată și cu timpul de expunere a celulelor la amigdalină. IC₅₀ pentru amigdalina pură și pentru amigdalina activată cu beta-D-glucozidaza, pentru un timp de 48 ore a fost de 458,10 mg/ml, respectiv 3,2 mg/ml. În plus, celulele apoptotice au fost evidențiate prin metoda colorării fluorescente AO/EB (acridina orange/bromura de etidiu) și prin analiza ciclului de viață al celulelor cu ajutorul citometriei în flux, folosind colorarea cu anexină V-FITC/PI. Astfel, rata apoptozei a crescut odată cu creșterea concentrației de amigdalină și a timpului de incubare. Aceste rezultate au fost comparate cu grupul de control și au relevat o diferență semnificativă (p<0,01). Toate aceste rezultate arată faptul că amigdalina nu avea o activitate citotoxică puternică asupra celulelor HepG2; totuși, amigdalina activată cu ajutorul beta-D-glucozidazei a manifestat o activitate citotoxică mult crescută și eficientă asupra acelorași celule HepG2. Așadar, concluzia este că folosirea acestei strategii de sporire a efectului amigdalinei poate fi aplicabilă cu succes în cazul tumorilor cu o activitate intensă.

Introducere

Amigdalina (D-mandelonitril-beta-D-gentiobioza), C₂₀H₂₇NO₁₁ este o glucozidă cianogenetică, izolată inițial din sâmburii de migdale amare (Prunus dulcis) și din alte plante alimentare, precum semințele de in și maniocul (Chwalek & Pié, 2004). Uneori, amigdalina este confundată cu levomandelonitrilul (acid cianofenil-metil-beta-D-glucopiranosiduronic), C₁₄H₁₅NO₇, cunoscut de obicei sub numele de laetril. Totuși, amigdalina și laetrilul sunt compuși chimici diferiți (Andrew, Roscoe & Andrew, 1980; Du și ceilalți, 2005). Se cunoaște faptul că, atunci când intră în contact cu apa, amigdalina se transformă în epimerul ei, neoamigdalina (L-mandelonitril-beta-D-gentiobioza) (Koo și ceilalți, 2005). Astfel, despre amigdalină se spune că este un produs natural antitumoral controversat, care a fost folosit ca substanță terapeutică alternativă în tratamentul pacienților bolnavi de cancer. Din perioada anilor ’50 pentru a trata pacienții bolnavi de cancer a fost elaborată o formă modificată a amigdalinei, cunoscută sub numele de laetril sau vitamina B17, dar aceasta nu este de fapt o vitamină. Studiile efectuate au arătat că această substanță nu este eficientă în tratarea cancerului, cauzând intoxicații periculoase cu acid cianhidric și, uneori, fiind chiar fatală, în cazuri reale. Laetrilul este, de asemenea, descompus prin acțiunea beta-D-glucozidazei, rezultând acid cianhidric, care stimulează în mod reflex centrul respirator și produce anumite efecte antitusive și antiastmatice (Badr & Tawfik, 2010; Lv, Yu & Zheng, 2005).

Studiile anterioare asupra amigdalinei s-au focalizat pe purificarea ei, pe toxicitatea legată de eliberarea de acid cianhidric, pe mecanismul antitumoral, pe identificarea metaboliților ei la nivelul plasmei sau la nivelul plantelor din care provine și pe efectele sale farmacologice asupra cancerului (Rauws, Gramberg & Olling, 1982). Pe lângă folosirea amigdalinei pentru activitatea sa antitumorală, această substanță și-a găsit utilizarea în tratamentul astmului, bronșitei, emfizemului pulmonar, precum și în cazul leprei și al diabetului.

Amigdalina a fost utilizată ca un medicament tradițional datorită beneficiilor medicale multiple, incluzând tratarea sau prevenirea cancerului, scăderea febrei, oprirea tusei și înlăturarea senzației de sete. Spre sfârșitul anilor ’70 și începutul anilor ’80, s-a evidențiat faptul că amigdalina distruge în mod selectiv celulele canceroase, fără a genera toxicitate sistemică, și că înlătură durerile în cazul bolnavilor de cancer. Totuși, Administrația americană pentru Alimente și Medicamente (FDA) nu a aprobat folosirea amigdalinei ca medicament pentru tratarea pacienților bolnavi de cancer, argumentând că nu sunt suficiente dovezi clinice referitoare la eficiența sa și la potențialul toxic. În ciuda eșecului studiilor clinice de a demonstra efectul anticancerigen al amigdalinei în SUA și în Europa, amigdalina continuă să fie produsă și administrată ca tratament anticancer în Europa de Nord și în Mexic (Chang, Shin & Yang, 2006; Kwon, Lee & Hong, 2010). Sunt puține studii care să cerceteze efectele farmacologice ale amigdalinei asupra celulelor HepG2.

Recent, studiile întreprinse de Chang & Zhang (2012) au demonstrat că amigdalina însăși nu are niciun efect antitumoral in vitro; mai degrabă, principiile active cu efecte antitumorale au fost identificate în produșii rezultați prin descompunerea amigdalinei. Totuși, s-a dovedit de mult faptul că amigdalina are un efect antitumoral cert in vivo.

Este cunoscut că, la nivelul intestinului, complexul enzimatic numit emulsină, conținând enzimele beta-D-glucozidază, benzocianază și altele, poate descompune amigdalina în mai mulți componenți. Inhibarea creșterii și inducția apoptozei de către amigdalină în forma pură, precum și de către amigdalina activată cu beta-D-glucozidază, au fost testate în cazul linei de celule de carcinom hepatocelular la om, HepG2. Așadar, obiectivele studiului de față au fost: (a) de a examina efectele amigdalinei asupra celulelor HepG2 și de a caracteriza apoptoza implicată; (b) de a investiga efectul amigdalinei activată cu beta-D-glucozidază asupra proliferării și apoptozei de la nivelul celulelor HepG2.

Materiale și metode

Materiale

Mediul de cultură pentru celule și reactivii necesari au fost cumpărați de la Gibco Laboratories (Grand Island, NY, SUA). Linia de celule HepG2 (HB8065) a fost obținută de la Chinese Academy of Science Cell Bank și a fost păstrată în laborator. Amigdalina, streptomicina, penicilina, L-glutamina și dimetil sulfoxidul (DMSO) au fost toate de puritate mai mare de 98% (Sigma Aldrich Corp.). Toate celelalte substanțe chimice fabricate în China au fost de puritate analitică. Mediul de cultură și antibioticele au fost cumpărate de la Gibco (Grand Island, NY, SUA). 0,25% tripsină-EDTA, ser fetal de bovină (FBS), beta-D-glucozidază (37 U/mg) și aminoacizi neesențiali au fost cumpărați de la Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). Kit-urile pentru analiza MTT, pentru colorare fluorescentă AO/EB și pentru detectarea apoptozei, Anexina V-FITC/PI, au fost cumpărate de la KeyGEN Biotech, Nanjing, China.

Cultura de celule

Celulele canceroase HepG2 (o linie de celule de hepatoblastom la om cu o varietate mare de răspunsuri metabolice specifice la diferite tipuri de medicamente) (Knowles, Howe & Aden, 1980) au fost cultivate în mediul RPMI1640 suplimentat cu 10% ser fetal de bovină (FBS) inactivat la temperatură înaltă, 100 U/ml penicilină, 100 µg/ml streptomicină, 1% aminoacizi neesențiali și 2mmol/L L-glutamină într-o atmosferă umidificată cu 95% aer, 5% CO₂, la 37°C. Celulele au fost subcultivate la fiecare 7 zile, cu o rație de împărțire de 1:3. Celulele folosite pentru experimente au fost de până la generația a 8-a, pentru a asigura stabilitatea liniei de celule. Mediul de cultură a fost reînnoit la fiecare 2 zile, iar celulele stocate au fost înghețate și păstrate în azot lichid.

Soluțiile de amigdalină (140 mg/ml) și beta-D-glucozidază (1 mg/ml) au fost preparate pe loc în mediu RPMI 1640 fără ser și apoi au fost filtrate prin filtre de 0,22µm de acetat de celuloză. Celulele de control au primit o cantitate echivalentă de RPMI 1640.

Testul MTT doza-răspuns de proliferare a celulelor

Testul MTT a fost folosit pentru a evalua activitatea antiproliferativă a amigdalinei și pentru testele degradării de grup. Testul MTT se bazează pe clivajul sării galbene de MTT tetrazolium în formazan de culoare purpurie, clivaj realizat de către celulele active din punct de vedere metabolic, această reacție fiind cuantificabilă pe baza fotometriei (Mosmann, 1983). O creștere a numărului de celule vii înseamnă o creștere a activității metabolice totale, ceea ce conduce la o formațiune colorată mai intens.

Pentru teste, celulele (5×10³ celule/godeu în 180 µL mediu complet RPMI 1640) au fost plasate în fiecare godeu dintr-o placă cu 96 de godeuri. S-a permis celulelor să adere la godeu timp de 24 de ore și apoi s-a adăugat 20 µL de mediu pentru creșterea completă a celulelor, în diferite concentrații ale mostrelor. Godeurile goale conțineau concentrațiile prezentate anterior ale mostrelor în 200 µL de mediu de cultură, dar fără celule. După 24, 48, 72 și 96 de ore de incubație, mediul a fost înlocuit cu 200 µL RPMI 1640 fără ser. În fiecare godeu s-a adăugat 50 µL de soluție MTT (5 mg/ml). După 4 ore de postincubație, mediul a fost îndepărtat și s-a adăugat 100 µL de DMSO în fiecare godeu pentru a solubiliza formazanul. Rezultatul a fost citit, folosind un aparat de scanare multiplă pentru laborator MCC/340 (Thermo electron Corporation, Barcelona), la o lungime de undă de 570 nm, cu o lungime de undă de referință de 690 nm. Rezultatele sunt exprimate ca procentaj al celulelor vii în raport cu celulele de control.

Doza medie efectiva IC₅₀, care reprezintă cantitatea de mostre în stare să inhibe cu 50% proliferarea celulelor, a fost calculată grafic pentru fiecare curbă de proliferare a celulelor.

Morfologia celulelor și adeziunea lor

Celulele au fost însămânțate într-o cutie Petri, la o densitate de 1×10⁵ celule/ml, cu sau fără indicarea concentrațiilor mostrelor și ale grupelor de test. La fiecare perioadă prestabilită de incubație (24, 48, 72 de ore) celulele au fost observate sub un microscop (TE2000-U, Nikon Corporation).

Evidențierea inducției apoptozei cu ajutorul testului AO/EB cu colorare dublă

Celulele însămânțate și tratate cu grupele de test în concentrații diferite au fost colorate in situ cu 2 µL amestec de 100 mg/l AO și 100 mg/l EB, fiind apoi observate cu un microscop cu fluorescență (Eclipse E 600, Nikon, Italy). Colorarea dublă permite deosebirea celulelor vii (L) de celulele apoptotice timpurii (EA), de celulele apoptotice târzii (LA) și de celulele necrozate (N). AO pătrunde în toate celulele și colorează nucleele în verde. EB este absorbită doar de către celulele care au o membrană citoplasmatică deteriorată, și nucleul celulelor LA și N este colorat în roșu. EB domină față de AO. Celulele L au un nucleu normal verde; celulele EA prezintă un nucleu verde strălucitor cu cromatină condensată sau fragmentată; în cazul celulelor LA, cromatina condensată și fragmentată este colorată în portocaliu; în sfârșit, celulele N au un nucleu normal din punct de vedere structural, colorat în portocaliu (Giantomassi și ceilalți, 2010).

Procentul de celule apoptotice a fost calculat ca raportul dintre celulele apoptotice și numărul total de celule. A fost realizată analiza morfometrică a imaginilor digitale înregistrate cu o cameră Coolpix cu o aceeași magnificație în 20 de locuri selectate aleatoriu pentru fiecare tratament, folosind analizorul de imagine Lucia. Celulele L, N, EA și LA au fost exprimate ca procente din numărul total de celule contorizate (Aljandali și ceilalți, 2001; Baskici, Popovici, Ristici și Arsenijevici, 2006). În cazul fiecărui tratament au fost numărate un minim de 400 de celule.

Analiza apoptozei cu ajutorul testului prin colorare cu Anexină V-FITC/PI

Celulele HepG2 (5×10⁵ celule/godeu), crescute 24 de ore în 6 godeuri, au fost folosite pentru experimentele cu Anexină V-FITC/PI. Apoptoza sau necroza au fost determinate, folosind kit-ul de detectare cu Anexină V-FITC/PI, după cum s-a menționat anterior (Dey & Cederbaum, 2006), acest test bazându-se pe observarea faptului că imediat după inițierea procesului de apoptoză, celulele translochează fosfatidilserina, prezentă la nivelul membranelor, de la nivelul feței interioare a membranei plasmatice la suprafața celulei, dar și pe observarea faptului că, de asemenea, celulele scad în dimensiuni, modificându-și caracteristicile de împrăștiere pe laturi și frontal. Odată ajunsă la suprafața celulei, fosfatidilserina poate fi detectată ușor, prin colorarea cu un conjugat fluorescent al anexinei V, care are o afinitate mare pentru fosfatidilserină. Celulele care au Anexină V-FITC lipită de suprafața lor (celulele apoptotice timpurii, EA) prezintă o fluorescență verzuie a membranei, în vreme ce celulele care și-au pierdut integritatea membranei vor prezenta o fluorescență roșie omogenă (iodura de propidiu, PI) a nucleului și un halou de colorație verzuie (FITC) la suprafața celulei (celulele apoptotice târzii, LA sau celulele necrotice, N).

Pe scurt, celulele HepG2 netratate și tratate au fost colectate, spălate de două ori în PBS rece ca gheața și apoi resuspendate în soluție tampon la o densitate de 5×10⁵ celule/ml. Apoi celulele au fost recoltate și resuspendate cu tripsină, colorate cu Anexină V (10 µg/ml) marcată cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) și PI (20 µg/ml) la 37°C, timp de 15 minute, în întuneric și analizate prin citometria în flux, folosind lungimi de undă de excitație/emisie de 488/525 nm și 488/675 nm pentru Anexină V și, respectiv, pentru PI. Celulele apoptotice, colorate pozitiv cu Anexină V, au prezentat o fluorescență verzuie și celulele necrotice au apărut ca celule cu fluorescență roșie.

În general, în analiza FACS, celulele cu Anexină V+/PI- au fost considerate ca fiind apoptotice (EA) și celulele cu Anexină V+/PI+ au fost considerate ca fiind necrozate (LA). Procentul de celule apoptotice a fost măsurat cu ajutorul analizei de sortare a celulelor activate fluorescent într-un analizor FACS (Becton Dickinson) și a fost calculat ca raport între numărul de celule apoptotice și numărul total de celule.

Analiza statistică

Datele au fost exprimate ca deviație medie standard și a fost efectuată analiza SPSS pentru determinarea semnificației statistice. Diferența dintre două grupuri a fost analizată cu ajutorul testului t al Studentului și diferența dintre trei sau mai multe grupuri a fost analizată folosind testele Duncan pentru domenii multiple. Diferența cu diferite litere p<0,01 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

REZULTATE

Efectele asupra proliferării celulelor HepG2

Pentru a investiga efectele amigdalinei în forma pură, precum și ale amigdalinei activate cu beta-D-glucozidază asupra proliferării celulelor, au fost realizate teste MTT cu diferite concentrații de amigdalină. Efectele inhibitorii asupra proliferării celulelor HepG2 în urma tratării grupelor de test cu diferite concentrații sunt prezentate în tabelul 1. Comparând rezultatele cu grupul de control, inhibarea proliferării celulelor HepG2 a crescut semnificativ (p<0,01) cu creșterea concentrațiilor de amigdalină și a timpului de incubație, în domeniul 0-14 mg/ml și 24-72 ore. După cum se poate vedea din tabelul 1, incubația cu amigdalină a condus la inhibarea proliferării celulelor HepG2 proporțional cu doza și timpul specific de incubație.

Doza medie eficientă (IC₅₀), care reprezintă cantitatea de mostre în stare să inhibe cu 50% proliferarea celulelor HepG2, a fost calculată grafic pentru fiecare curbă de proliferare a celulelor. Astfel, IC₅₀ pentru amigdalina pură și pentru amigdalina activată cu beta-D-glucozidază, pe o perioadă de 48 de ore, a fost 458,10 mg/ml și, respectiv, 3,2 mg/ml. Valorile lui IC₅₀ indicate în fig.1E arată că prezența beta-D-glucozidazei, ce favorizează hidroliza amigdalinei, a condus la o creștere semnificativă (de aproape 150 de ori) a inhibării creșterii celulelor HepG2.

Efecte asupra morfologiei și adeziunii celulelor HepG2

Schimbarea morfologiei celulelor HepG2 datorită tratamentului cu amigdalină al grupelor de test timp de 24 de ore este prezentată în fig. 2. Comparat cu volumul celulelor de control, volumul celulelor tratate a fost relativ mai mic și au apărut protuberanțe și desfigurări la nivelul membranei celulare. După 72 de ore, celulele tratate se puteau aduna ușor împreună, ceea ce arată ca tratamentul grupelor de test a crescut aderența celulelor HepG2.

Apoptoza indusă la nivelul celulelor HepG2

Pentru a estima cantitativ apoptoza produsă de la sine și apoptoza indusă cu ajutorul amigdalinei la nivelul celulelor HepG2 a fost necesară investigarea viabilității celulelor și a căilor apoptozei. Rezultatele alterărilor morfologice la nivelul celulelor HepG2 produse pe o perioadă de 24-72 de ore tratamentul cu amigdalină pură, respectiv cu amigdalină activată cu beta-D-glucozidază, sunt prezentate în fig. 3. Celulele tratate, colorate cu AO/EB și DAPI au prezentat condensări și fragmentări la nivelul nucleelor, proporțional cu doza de amigdalină și cu timpul de expunere. Au fost observate, de asemenea, fenotipuri tipice ale apoptozei, precum scăderea citoplasmei și umflarea membranei.

Efectele asupra ratei de apoptoză a celulelor HepG2

Efectele amigdalinei asupra ratei de apoptoză a celulelor HepG2, folosind măsurarea cu ajutorul colorării duble AO/EB la 24, 48 și 72 de ore sunt prezentate în tabelul 2. La 24, 48 și 72 de ore, toate grupele de test au produs un procent de apoptoză semnificativ mai mare (p<0,01), comparativ cu grupul de control.

Efectele amigdalinei asupra ratei de apoptoză la nivelul celulelor HepG2, efecte evaluate folosind citometria în flux și colorarea cu Anexină V-FITC/PI, cu măsurători efectuate la 24, 48 și 72 de ore, sunt prezentate în fig. 4. Astfel, toate celulele tratate au prezentat anumite trăsături morfologice cum ar fi condensarea nucleară (pyknosis) și fragmentarea (karyorrhexis), aspecte aflate în concordanță cu moartea programată a celulelor prin apoptoză, care au servit drept confirmare vizuală a analizei ciclului celular. Rata de apoptoză în cazul celulelor HepG2 tratate cu amigdalină și măsurate prin colorarea cu Anexină V-FITC/PI este prezentată în tabelul 2.

Discuție

Amigdalina a fost utilizată ca agent citotoxic împotriva cancerului și pacienții tratați prin terapii convenționale au folosit amigdalina ca un medicament alternativ contra cancerului vreme de 40 de ani (Nahrstedt, Sattar & El-Zalaban, 1990). În cantități mici, glicozide precum amigdalina exercită efecte expectorante, sedative și digestive. De la descoperirea ei, din 1845, mulți cercetători au raportat activitatea antitumorală a amigdalinei in vitro. Totuși, unii cercetători au fost de părere că acest “tratament alternativ al bolnavilor de cancer” nu a fost susținut de rezultate evidente încurajatoare deoarece unele dintre tratamentele alternative prezintă riscuri considerabile (Ge, Chen, Han & Chen, 2007). Studiul de față demonstrează că amigdalina pură, în sine, precum și amigdalina activată cu beta-D-glucozidază inhibă proliferarea și induce apoptoza la nivelul celulelor HepG2 ale hepatoblastomului la om. Rezultatele similare prezentate în tabelele 1 și 2 indică faptul că amigdalina în sine nu prezintă o activitate puternică anti-HepG2; totuși, ingredientele amigdalinei activate cu beta-D-glucozidază prezintă o activitate eficientă anti-HepG2. Pentru o evaluare mai bună a trăsăturilor apoptotice au fost utilizate kit-urile pentru colorarea dublă AO/EB și pentru detecția apoptozei cu Anexina V-FITC/PI (fig. 3 și 4). Apoptoza, un proces esențial pentru controlarea numărului de celule în multe procese de dezvoltare și fiziologice, s-a descoperit că este afectată în cazul multor tumori la om, acest aspect sugerând că perturbarea funcției apoptotice contribuie substanțial la transformarea unei celule normale într-o celulă tumorală (Kawata, Osawa & Okabe, 2009; Lee și ceilalți, 2004; Zhang & Popovich, 2008; Zhang și ceilalți, 2011). Apoptoza este un fenomen important în inducerea distrugerii celulelor tumorale prin chimioterapie (Lin și ceilalți, 2007; Mochizuki și ceilalți, 2009). În prezentul studiu, apoptoza a fost evaluată folosind trei criterii și anume, morfologia celulelor (fig. 2), cercetarea calitativă folosind metoda colorării cu AO/EB (fig. 3) și citometria în flux folosind colorarea cu Anexină V-FITC/PI (fig. 4) și a fost evaluată prin rata de apoptoză (Tabelul 2).

S-a raportat că amigdalina se descompune în benzaldehidă, glucoză și acid cianhidric, un ingredient-cheie pentru distrugerea celulelor tumorale, fiind totuși toxic și pentru pacienți (Günata, Bayonove, Tapiero & Cordonnier, 1990; Günata, Bayonove, Tapiero & Cordonnier, Arnaud & Galzy, 1990b; Nout, Tuncel & Bimer, 1995). După cum este arătat în fig. 1C și D, am emis ipoteza că mecanismul potențial al descompunerii amigdalinei cu ajutorul beta-D-glucozidazei poate fi prin hidroliza secvențială a amigdalinei care, astfel, trece în prunasină și, apoi, în mandelonitril, un mecanism secvențial tipic cu reacții de hidroliză în doi pași (fig. 1C). În plus, amigdalina este hidrolizată direct până la mandelonitril, fiind vorba despre un mecanism simultan de hidroliza ce presupune o reacție de hidroliză într-un singur pas (fig 1 D). Mandelonitrilul poate hidroliza spontan, rezultând acid cianhidric și benzaldehidă, sau poate fi descompus pe cale enzimatică de către enzima numita benzocianază prezentă în complexul enzimatic emulsină. Mandelonitril glucuronida poate fi hidrolizată la locul tumorii de către beta-glucuronidază, rezultând acid cianhidric, banzaldehidă și acid glucuronic. Așadar, in vivo, complexul enzimatic emulsină, conținând enzimele beta-D-glucozidază, benzocianază și altele, descompune amigdalina în patru compuși: acid cianhidric, benzaldehidă, prunasină și mandelonitril, care sunt absorbiți în circulația limfatică și portală (Chang & Zhang, 2012). Deci, injectarea amigdalinei este o cale mai bună de administrare decât calea orală.

Carcinomul hepatocelular este una dintre cele mai cunoscute tumori maligne în întreaga lume și poate una dintre cele mai cunoscute forme fatale de cancer, în special în țările Asiei de Est (Chen, Lv, Liu & Xu, 2009; Martin și ceilalți, 2008). În aceste cazuri este preferată rezecția chirurgicală. Din păcate, mulți pacienți cu această boală prezintă deja metastaze în momentul diagnosticului inițial; astfel, rezecția chirurgicală nu este cea mai bună alegere datorită prezenței și a altor modificări patologice (Yoo și ceilalți, 2002). În cazul pacienților cu boala în stadiu avansat, durata medie de supraviețuire este de un an sau mai puțin. Așadar, dezvoltarea unui nou tratament sau al unei noi strategii terapeutice pentru tratarea acestei boli rămâne un deziderat important, constituind, totodată, o provocare pentru specialiștii din domeniul medical (Colo, 1998). Bazat pe abordarea studiului la nivel molecular, acest studiu a prezentat o nouă descoperire și anume, că tratamentul cu amigdalină activată cu ajutorul beta-D-glucozidazei conduce la o creștere a apoptozei la nivelul celulelor HepG2 de la om. Astfel, tratamentul cu amigdalină activată cu beta-D-glucozidază poate permite folosirea unei doze mai mici de amigdalină; administrarea simultană a acestor două substanțe a condus la o creștere impresionantă a procesului de distrugere a celulelor tumorale, scăzând, pe de altă parte, toxicitatea tratamentului. Așadar, o sugestie bună ar fi ca această strategie de combinare a amigdalinei cu beta-D-glucozidaza să fie folosită pentru tratarea tumorilor cu o activitate sporită. Totuși, beneficiul clinic actual al acestei aplicații trebuie să fie verificat de studii ulterioare amănunțite in vivo și, fără îndoială, studiile in vivo pe animale, precum și studiile pe om vor oferi și mai multe dovezi în această privință. Studiile clinice viitoare au de clarificat modul precis prin care se produce moartea celulară, precum și mecanismul citoactiv atribuit amigdalinei activate cu beta-D-glucozidază.

Concluzii

În acest material, au fost investigate efectele inhibitorii ale amigdalinei simple și ale amigdalinei activate cu beta-D-glucozidază asupra liniei de celule HepG2. Comparativ cu amigdalina simplă, amigdalina activată a prezentat un efect inhibitor mai puternic asupra ratei de proliferare a celulelor testate. Efectele apoptozei au fost evaluate pe trei criterii, morfologia celulelor tratate cu amigdalină activată a prezentat neregularități și capacitatea de adeziune a celulelor a crescut. Mai mult, nucleele celulelor au prezentat caracteristicile apoptozei. În ceea ce privește potențialul de toxicitate al tratamentului cu amigdalină, s-a remarcat faptul că administrarea amigdalinei pe cale injectabilă este o modalitate mai bună de tratament. În plus, tratamentul folosind strategia de activare a amigdalinei cu beta-D-glucozidază poate permite administrarea unei doze mai reduse de medicament.

/p

/p