Inductia apoptozei de către extractul din Persicae semen în cazul celulelor HL-60 afectate de leucemia promielocitară la om

Hee-Young Kwon, Seon-Pyo Hong, Dong-Hoon Hahn si Jeong Hee Kim

Department of Biochemistry, College of Dentistry and Department of Oriental Pharmaceutical Sciences, Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea

Rezumat

Un ingredient important al Persicae semen este amigdalina, un compus cianogenic, numită și D-mandelonitril-?-gentiobioza. Rezultatele controversate referitoare la activitatea anticancerigenă a amigdalinei au apărut datorită conversiei amigdalinei în izomerul său inactiv, neoamigdalina. Pentru a inhiba procesul de epimerizare a amigdalinei s-a utilizat o nouă metodă simplă de fierbere în acid pentru prepararea extractului din Persicae semen. Analiza HPLC a relevat faptul că majoritatea amigdalinei din extract este, astfel, în forma activă, D. Acest extract din Persicae semen a fost folosit pentru a analiza efectul amigdalinei asupra proliferării celulelor și asupra inducției apoptozei la nivelul celulelor HL-60 din leucemia promielocitară la om. Astfel, s-a descoperit că extractul din Persicae semen a fost citotoxic pentru celulele HL-60 la concentrația de 6,4 mg/ml în prezența a 250nM de ?-glucozidază. Efectele antiproliferative ale extractului din Persicae semen par să fie datorate faptului că induce moartea celulelor prin apoptoză, știut fiind faptul că extractul din Persicae semen induce schimbări în morfologia nucleului celulei și fragmentarea ADN-ului la nivel internucleozomal.

Introducere

Un număr de compuși extrași și purificați din plante, precum și derivații acestora, prezintă activitate anticancerigenă. Unii dintre acești compuși utilizați în clinicile de specialitate includ: paclitaxel, vincristine, podophyllotoxin, camptothecin, fiind derivați, respectiv, din Taxus brevifolia L., Catharanthus roseus G. Don, Podophyllum peltatum L., Camptotheca acuminata (Lilenbaum și Green, 1993; Pezutto, 1997; Bertrand și Sané, 1999). Mai recent, s-au izolat constituenți citotoxici din Anthriscus sylvestris (Lim și ceilalți) și s-a descoperit că un metabolit al saponinei din ginseng induce apoptoza prin activarea mediată de citocrom c a enzimei caspaza 3 (Lee și ceilalti, 2000).

Amigdalina (D-mandelonitril-?-gentiobioza) este un compus cianogenic care se găsește în migdalele dulci și amare, Persicae semen și Armeniacae semen (Isozaki și ceilalți, 2001; Dicenta și ceilalți, 2002). Amigdalina este descompusă în mandelonitril și glucoza de către ?-glucozidaza (Brimer și ceilalți, 1996), fiind considerată o substanță controversată în tratamentul pacienților bolnavi de cancer (Koeffler și ceilalți, 1980; Newmark și ceilalți, 1981; Moertel și ceilalți, 1982). Se pare că rezultatele controversate au apărut datorită faptului că amigdalina este transformată în apă în epimerul sau ineficient, neoamigdalina (L-mandelonitril-?-gentiobioza) (Takayama și ceilalți, 1984). Recent, s-au raportat metode de purificare și de determinare a prezenței epimerilor amigdalinei prin utilizarea electroforezei capilare (Kang și ceilalți, 2000; Isozaki și ceilalți, 2001). Totuși, aceste metode nu sunt aplicabile amigdalinei din produsele naturale. Datorită faptului că conversia amigdalinei în neoamigdalina este inhibată prin fierberea în mediu acid (Hwang și ceilalți, 2002), au fost preparate extracte din Persicae semen prin metoda simplă a fierberii în mediu acid. Extractul a fost analizat pentru determinarea conținutului de amigdalină și a fost folosit pentru investigarea activității sale citotoxice.

MATERIALE și METODE

Prepararea extractului din Persicae semen

Învelișul exterior al Persicae semen a fost îndepărtat și s-a realizat extractul din miezul sâmburilor, prin fierbere în apa distilată în prezența acidului citric 0,1% timp de 3 ore. Apoi, extractul a fost filtrat și filtratul a fost concentrat cu ajutorul unui evaporator rotativ sub vid (Eyela, Japan) la presiune scăzută. Reziduul a fost liofilizat într-un liofilizator (Ilsin, Korea) și stocat la -70°C. Pudra a fost dizolvată în dimetil sulfoxid (DMSO) și diluată cu fosfat tamponat salin (PBS, pH 7,4) pentru a obține concentrațiile finale ale extractului total, de la 0,8 la 120 µg/ml. Amigdalina standardizată a fost obținută de la Tokio Kasei Chemical Co. (Tokyo, Japan). Metanolul a fost cumpărat de la firma Merck (Darmstadt, Germania). Restul reactivilor și solvenților folosiți au fost de grad analitic sau garantat. Apa distilată a fost ultrapurificată cu ajutorul unui sistem de purificare a apei (Pure Power III, Taiwan).

Sistemul HPLC a constat într-o pompa M 930 (Young Lin, Kyunggi, Korea) și un detector UV M 720 (Young Lin, Kyunggi, Korea) setat la 214 nm. Coloana a fost Capcell Pak C18, Tip UG120 (250 mm × 4,6 mm, Shiseido, Japan), la 35°C. Faza mobilă a fost 25% metanol-apa la 1 ml/min. Curba de calibrare a fost construită folosind șase concentrații diferite de soluție standardizată, conținând 30, 60, 90, 120 și 150 µg amigdalina/ml. A fost calculată zona de vârf pentru punctul de calibrare.

Cultura de celule și testul de citotoxicitate

Celulele de leucemie promielocitară la om (HL-60, ATCC CCL240) au fost cultivate în mediul RPMI 1640, suplimentat cu 10% ser fetal de bovină, 2mM L-glutamină, 1mM piruvat de sodiu, aminoacizi nonesențiali și antibiotice, într-un incubator umidificat, cu 5% CO₂ și 95% aer la 37°C. A fost realizat testul de rutină cu soluție albastră de tripan pentru a testa viabilitatea celulelor. Celulele HL-60 care cresc exponențial au fost însămânțate la o concentrație de 5×10⁵ celule pe godeu, într-o placă cu 96 godeuri și tratate cu concentrațiile indicate de extract sau vehicul. Atunci când a fost indicat, s-a adăugat în mediu ?-glucozidaza până la 250 nM. După diferiți timpi de expunere, viabilitatea generală a culturilor de celule a fost determinată prin testarea reducerii la formazan a substanței 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromură (Monks si ceilalti, 1991). Experimentele au fost realizate de trei ori.

Colorarea nucleară cu iodură de propidium

Celulele folosite în acest studiu au fost observate constant cu ajutorul unui microscop cu inversie și contrast de fază (Olympus, Japan). Celulele au fost plasate într-un godeu de cultură de 60 mm la o concentrație de 1×10⁵ celule/ml. La 16 ore după plasarea celulelor, acestea au fost tratate cu diferite concentrații de extract de amigdalină, împreună cu 250nM de ?-glucozidază. După 7 ore, celulele au fost recoltate prin centrifugare și spălate de două ori cu soluție tampon de fosfat salin (PBS). După aceea, celulele au fost resuspendate într-o soluție tampon de fosfat salin, la o concentrație de 5×10⁵ celule/ml și puse pe o lamelă de microscop, folosind citospin (Hanil, Korea), fiind lăsate la temperatura camerei pentru uscare. Celulele au fost fixate cu etanol rece, la întuneric. Celulele fixate au fost spălate cu PBS și colorate cu o soluție de 2,5 mg/ml de iodură de propidium și 100 mg/ml RNaza fără DNaza. Morfologia celulelor colorate a fost studiată cu ajutorul unui microscop cu fluorescență (Nikon E 800, Japan).

Analiza fragmentării ADN-ului

ADN-ul a fost purificat cum s-a descris anterior (Hyun și ceilalți, 1997). Celulele au fost crescute la o densitate de 1×10⁶ celule/ml și au fost tratate cu diferite concentrații de extract de Persicae semen, cu 250 nM de ?-glucozidază, într-un interval de timp de la 0 la 48 de ore. Fragmentele de ADN rezultate și purificate au fost supuse electroforezei în gel de agaroză și au fost vizualizate prin colorarea cu bromură de etidium. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru fiecare din cele trei experimente independente realizate.

Rezultate

Analiza cu ajutorul HPLC a extractului preparat din Persicae semen

Fig. 1 este o cromatogramă realizată prin cromatografie cu faza inversă a amigdalinei extrasă din Persicae semen, cu 25% metanol ca fază mobilă după extracția cu apă. Vârful amigdalinei a fost complet separat în această metodă, fără alt tratament prealabil. Structura amigdalinei este prezentată în fig. 2. Curba de calibrare între aria de vârf și concentrația amigdalinei standardizate arată o liniaritate excelentă (r²=0,9996). Conținutul de amigdalină a fost de 18% extract din Persicae semen (fig. 1).

Citotoxicitatea exctractului din Persicae semen

Efectul extractului din Persicae semen asupra proliferării celulare a fost evaluat cu ajutorul unui test MTT. O expunere timp de 48 de ore la acest extract a scăzut dramatic proliferarea celulelor HL-60, proporțional cu doza de extract administrată (fig. 3). Concentrația extractului de Persicae semen necesară pentru inhibarea proliferării celulelor cu 50% (IC₅₀) a fost de aproximativ 11 mg/ml. În prezenta ?-glucozidazei a fost necesară o concentrație IC₅₀ mai scăzută, doar de 6,4 mg/ml. Celulele de control, tratate doar cu substanța vehicul, nu au prezentat niciun fel de schimbări în ceea ce privește proliferarea celulelor sau viabilitatea lor. Atunci când s-a folosit amigdalina purificată, IC₅₀ a fost aproximativ 18% din IC₅₀ pentru extract, acest rezultat fiind în concordanță cu conținutul de amigdalină din extractul de Persicae semen, aspect confirmat prin analiza HPLC.

Inducția apoptozei de către extractul din Persicae semen

Pentru a determina dacă efectul antiproliferativ al extractului din Persicae semen este asociat cu moartea programată a celulelor sau, cu alte cuvinte, cu apoptoza, au fost determinate mai întâi schimbările morfologice la nivelul celulelor HL-60 tratate cu extract din Persicae semen în prezența ?-glucozidazei timp de 7 ore. Astfel, celulele expuse extractului din Persicae semen au prezentat o morfologie apoptotică caracteristică, incluzând apariția corpurilor apoptotice și a cromatinei condensate la nivelul nucleelor (fig. 4).

În plus față de determinarea morfologică, inducția apoptozei de către extractul din Persicae semen a fost stabilită cu ajutorul unui test elaborat pentru a evalua fragmentarea ADN-ului, aspect biochimic caracteristic pentru moartea celulară prin apoptoză. După cum este ilustrat în fig. 5, electroforeza în gel de agaroză a ADN-ului cromozomial, extras din celulele HL-60 tratate cu extract din Persicae semen în prezența ?-glucozidazei, a evidențiat în mod distinct fragmentarea internucleozomală a ADN-ului într-o scară de 180 bp nuclozomi. Intensitatea acestei scări de ADN a crescut progresiv, proporțional cu timpul și doza de extract din Persicae semen. Fragmentarea ADN-ului a fost observată prima dată la 3 ore după incubarea cu 10 mg/ml și la 7 ore după incubarea cu 5 mg/ml de extract din Persicae semen.

DISCUȚIE

Amigdalina (D-mandelonitril-?-gentiobioza), un ingredient major al Persicae semen, este studiată de mulți ani pentru importanța sa în tratamentul pacienților bolnavi de cancer (Koeffler și ceilalți, 1980; Moertel și ceilalți, 1982; Syrigos și ceilalți, 1998). Amigdalina este hidrolizată de către enzima ?-glucozidaza, rezultând prunasina (D-mandelonitril monoglucozida) și, apoi, prunasina este hidrolizată din nou de către aceeași enzimă, rezultând mandelonitril. Activitatea anticanceroasă a amigdalinei, un compus cianogenic, este un subiect controversat. Totuși, este cunoscut faptul că amigdalina aflată în soluție apoasă este epimerizată în neoamigdalină (L-mandelonitril-?-gentiobioza), care este o substanță inactivă împotriva cancerului (Takayama și Kawai, 1984). Ținând cont de acest aspect, a fost elaborată o metodă de extracție a amigdalinei care inhibă conversia formei D în forma L a amigdalinei (Hwang și ceilalți, 2002). Această metodă a fost folosită pentru prepararea extractului din Persicae semen, extract folosit pentru investigarea activității anticancerigene a amigdalinei.

Astfel preparat, extractul din Persicae semen a redus viabilitatea celulelor canceroase HL-60 din leucemia promielocitară de la om. Un indice IC₅₀ mai scazut s-a obținut prin administrarea ?-glucozidazei împreună cu extractul din Persicae semen. Pentru a determina dacă efectele inhibitorii asupra creșterii și proliferării celulelor canceroase ale extractului din Persicae semen sunt asociate cu moartea programată a celulelor sau, cu alte cuvinte, cu apoptoza, s-au examinat mai întâi schimbările morfologice induse de extractul de Persicae semen la nivelul celulelor HL-60. Astfel, analiza microscopică a celulelor tratate cu extract din Persicae semen a indicat că aceste celule au suferit schimbări morfologice majore. Apoptoza este un proces activ care conduce în final la activarea endonucleazelor și la scindarea ADN-ului în fragmente de aproximativ 180-200 perechi de bază (Kerr și ceilalți, 1994). Prin urmare, expunerea celulelor canceroase la extractul din Persicae semen a condus la fragmentarea ADN-ului celular într-o modalitate caracteristică morții celulare prin apoptoză. Studii farmacologice și diferite teste clinice sunt efectuate pentru validarea utilizării amigdalinei ca un agent anticancerigen (Strugala și ceilalți, 1995; Llorens și ceilalți, 1998; Syrigos și ceilalți, 1998; Yuan și ceilalți, 1999). Recent, amigdalina a fost utilizată ca medicament într-un tratament cu enzima dirijată de anticorpi (Syrigos și ceilalți, 1998). ?-glucozidaza a fost legată de un anticorp monoclonal asociat tumorii și, astfel, efectul citotoxic al amigdalinei asupra celulelor canceroase a fost sporit foarte mult. Totuși, pentru a face din exctractul din Persicae semen un medicament, este necesar să fie efectuate mai multe studii referitoare la mecanismele de acțiune, precum și studii privitoare la activitatea amigdalinei in vivo.