Bicarbonatul și dicloracetatul: evaluarea terapiilor pentru modificarea pH-ului într-un model de cobai cu cancer de sân metastatic

 

 

Ian F. Robey si Natasha K. Martin

 

Cadru

 

Natura glicolitică a tumorilor maligne conduce la niveluri ridicate de aciditate extracelulară în mediul înconjurător al tumorii. Aciditatea tumorală este o forță care susține invazia și metastazele. Recent, s-a arătat că neutralizarea acidității extracelulare prin administrarea sistematică pe cale orală a bicarbonatului de sodiu poate inhiba răspândirea metastazelor într-un model de cobai cu cancer de sân metastatic. În vreme ce aceste rezultate sunt convingătoare, cercetările recente în ceea ce privește utilizarea pe cale orală a bicarbonatului de sodiu ca tratament pentru pacienții bolnavi de cancer relevă anumite limitări.

 

Metode

 

Am presupus că siguranța și eficiența administrării de bicarbonat de sodiu ar putea fi sporită prin folosirea dicloracetatului (DCA), un medicament care acționează selectiv asupra celulelor tumorale și reduce aciditatea extracelulară prin inhibarea glicolizei. Folosind un model de cobai cu cancer de sân metastatic (MDA-MB-231), am elaborat un studiu care vizează intervenția în scopul supraviețuirii cobaiului, cobai care a primit bicarbonat de sodiu, DCA sau DCA-bicarbonat (DB) sub formă de tratament de lungă durată.

 

Rezultate

Dicloracetatul singur sau în combinație cu bicarbonatul nu a crescut alcaloza sistemică la cobai. Supraviețuirea de cea mai lungă durată a fost în cazul administrării terapiilor bazate pe bicarbonat de sodiu. Reapariția tumorii primare după eliminarea ei chirurgicală este asociată cu ratele de supraviețuire. Deși terapia cu DB nu a crescut semnificativ eficiența administrării de bicarbonat pe cale orală, totuși, au fost observate leziuni pulmonare mai reduse în diametru în cazul acestui grup de cobai.

 

Pe de altă parte, terapia simplă, doar cu DCA, nu a fost eficientă pentru reducerea dimensiunii tumorii sau a metastazelor și nici pentru creșterea timpului de supraviețuire. Avem probe in vitro care sugerează că acest rezultat poate depinde de hipoxia prezentă în zona tumorii.

 

Concluzii

 

Tratamentul combinat DB nu pare să sporească efectul administrării îndelungate pe cale orală a bicarbonatului de sodiu. Astfel, efectul antitumoral al DCA poate fi dependent de modelul de cancer. Așadar, eficiența DCA este imprevizibilă ca tratament anticancer și, prin urmare, sunt necesare studii ulterioare care să determine rolul acestui agent în microclimatul tumorii.

 

 

 

Cadru

 

pH-ul extracelular al tumorilor maligne este acid (pH 6,5-6,9), comparativ cu pH-ul țesutului normal. (pH 7,2-7,4). Aciditatea tumorală se pare că joacă un rol esențial în rezistența la chimioterapie și în riscul formării metastazelor. De exemplu, condițiile acide de cultură cresc formațiunile numite filopodii și, de asemenea, cresc expresia enzimelor proteolitice implicate în invazie. Alte rapoarte descriu creșterea invaziei și creșterea activității cathepsinei B în cazul celulelor tumorale crescute în mediu de cultură acid. De asemenea, s-a demonstrat și in vivo faptul că potențialul metastatic este crescut de prezența mediului acid. Astfel, celulele tumorale tratate în prealabil în pH acid înainte de injecția venoasă au format un număr mare de metastaze pulmonare și, de asemenea, au modificat activitatea factorilor implicați în metastaze, cum ar fi proteazele serinei și factorii angiogenici.

 

Deși pH-ul extracelular scăzut al tumorii este în strânsă legătură cu numeroase mecanisme celulare, incluzând anhidrazele carbonice, ATP-azele vacuolare și schimbătorii de ioni de sodiu, totuși, glicoliza este considerată factorul major în creșterea și menținerea acidității tumorale. Glicoliza tumorală excesivă, chiar și în prezența oxigenului, este un semn al malignității și conduce la creșterea producției de acid lactic. Faptul că pH-ul acid este suficient pentru declanșarea invaziei celulelor tumorale, ne conduce la presupunerea că neutralizarea pH-ului tumoral acid va inhiba invazia și va încetini răspândirea metastazelor. Această presupoziție a fost testată într-un studiu de supraviețuire pe cobai cu tumoră. Astfel, s-a administrat apă de băut cu bicarbonat de sodiu unor femele de șoarece cu tumoră la sân MDA-MB-231. Studiul a arătat că administrarea sistematică de bicarbonat de sodiu a adus pH-ul extracelular al tumorilor la niveluri neutre (pH 7,2) și a inhibat răspândirea metastazelor, fapt care a condus la o rată de supraviețuire mai ridicată. De asemenea, bicarbonatul de sodiu a fost eficient împotriva răspândirii metastazelor într-un model pentru cancerul de prostată.

 

Sunt necesare anumite măsurători înainte de a considera neutralizarea acidității tumorale drept abordare eficientă în tratamentul pacienților bolnavi de cancer. Astfel, este necesar să se identifice și să se valideze dozele eficiente, tipurile de tumori susceptibile la acest tratament, soluțiile tampopn ideale, abordările cele mai sigure și alți factori din microclimatul tumoral. Pentru a completa înțelegerea acestor fenomene, au fost elaborate modele matematice pentru a prezice siguranța și eficiența neutralizării sistematice a acidității tumorale la oameni. Rezultatele noastre sugerează că utilizarea pe termen lung a bicarbonatului de sodiu drept tratament pentru pacienții bolnavi de cancer este limitată. Dozele sigure pentru consum limitează cantitativ capacitatea de a contracara, prin neutralizare, producția de protoni extracelulari de către celulele tumorale. Într-un studiu anterior s-a raportat că doza limită (superioară) de bicarbonat de sodiu administrat pe cale orală la cobai (care înseamnă aproximativ 0,18 g/kg/zi la oameni) a fost suficientă doar pentru a contracara aciditatea produsă de o tumoră de 15 mg, constând din aproximativ 100000 de celule sau 1 mm³. Mai mult, administrarea pe termen lung a bicarbonatului de sodiu pe cale orală în doze mai mari de 0,5 g/kg/zi se presupune că poate induce alcaloza sistemică (Martin N, Robey I, Gaffney E, Gillies R, Gatenby R, Maini P: Predicția siguranței și eficienței terapiei cu soluții tampon pentru a crește pHe tumoral: Un studiu de modelare integratoare). Așadar, este de presupus că siguranța și eficiența administrării pe cale orală a bicarbonatului ar putea fi sporită de către alți reactivi care vizează direct sau indirect procesele care țin de aciditatea tumorală extracelulară.

 

O posibilă metodă pentru a crește eficiența neutralizării pH-ului extracelular este administrarea dicloracetatului (DCA). Acest analog al acidului acetic acționează selectiv asupra metabolismului celulelor tumorale prin activarea indirectă a piruvat dehidrogenazei (PDH) prin inhibarea activității kinazei piruvat dehidrogenaza (PDK). Modificarea activității PDH schimbă metabolismul piruvatului în acid lactic, în condițiile cascadei glicolitice către producerea de acetil-CoA, care intră în ciclul Krebs pentru a conduce fosforilarea oxidativă. Această schimbare conduce la glicoliza celulară scăzută, având drept urmare o creștere a pH-ului extracelular. De asemenea, această schimbare declanșează la nivelul mitocondriilor multiple evenimente semnalizând apoptoza. Pentru a verifica dacă DCA și bicarbonatul reprezintă o intervenție terapeutică viabilă în bolile metastatice, am făcut un studiu de supraviețuire pe cobai cu cancer de sân metastatic MDA-MB-231, împărțiți în patru grupe de tratament: 1) netratați; 2) tratați cu bicarbonat; 3) tratați cu DCA și 4) tratați cu DCA și bicarbonat (DB).

 

Metode

 

Experimentele pe animale

 

Toate animalele au fost tratate conform protocoalelor IACUC (Institutional Animal Care and Use Comittee) la universitatea din Arizona. Cobai femelă SCID de 6-8 săptămâni au fost injectați în zona mamară cu 5×10⁶ MDA-MB-231/eGFP celule tumorale. Apoi, cobaii au fost împărțiți în patru grupe: 1) netratați; 2) tratați cu bicarbonat de sodiu (Sigma, St. Louis, MO), 200 mM (echivalentul a 3,2 g/kg/zi la cobai); 3) tratați cu dicloracetat de sodiu (DCA) (Sigma, St. Louis, MO), 5 mM (echivalentul a 112 mg/kg/zi); și 4) tratați cu combinația formată din bicarbonat de sodiu (200 mM) plus dicloracetat de sodiu (5 mM) (DB). Numărul de cobai din fiecare grup a fost de 16 cobai. Animalele au fost monitorizate și îngrijite de Experimental Mouse Shared Services (EMSS) din Arizona Cancer Center, Tucson Arzona. Volumele tumorilor primare din zona mamară au fost măsurate de două ori pe săptămână și au fost calculate cu ajutorul măsurătorilor ortogonale ale dimensiunilor exterioare, folosind formula (lățimea)²×(lungimea)/2. Îndepărtarea chirurgicală a tumorilor primare a fost făcută între zilele 28-50, când tumorile erau de aproximativ 500 mm³. Cobaii au fost eutanasiați în cazul în care povara tumorii a fost excesivă (primară, intraperitoneală sau la nivelul ganglionilor limfatici >2000 mm³) sau în cazul în care cobaii erau muribunzi. Tehnicianul EMSS, care nu a știu despre studiul realizat, a monitorizat cobaii de două ori pe săptămână.

 

Urina de la cobai a fost obținută prin aplicarea ușoară a unei presiuni abdominale timp de 10 secunde, folosind drept suport o folie de plastic. Urina a fost colectată cu o micropipetă și transferată într-o eprubetă de 0,6 mL pentru măsurarea pH-ului. Serul a fost colectat prin puncție la nivelul inimii, după eutanasierea cobailor. Sângele a fost centrifugat și serul a fost colectat pentru măsurarea pH-ului. Urina și pH-ul serului au fost măsurate cu ajutorul unui pH-metru Mettler Toledo, folosind o probă InLab^®Micro.

 

Măsurătorile metastazelor

 

La sfârșitul experimentului de supraviețuire s-a făcut necropsia cobailor pentru a identifica metastazele tumorale. Tumorile colorate în verde fluorescent au fost detectate cu ajutorul aparatului Illumatool Bright Light System (LT-9500), folosind un filtru de excitație de 470/40 nm (Lighttools Research) și au fost fotografiate folosind o cameră digitală PowerShot SD750 (Canon, Lake Success, NY)

 

Imaginile au fost capturate în același plan focal în prezența excitației de 480 nm și a emisiei filtrate > 490 nm. Imaginile plămânului întreg au fost analizate cu ajutorul programului Adobe Photoshop 5.0, folosind “bagheta” magică pentru a selecta zona plămânilor și leziunile tumorale cu fluorescență verde. Zona pixelată a imaginilor selectate a fost măsurată folosind ImageJ.

 

Experimentele referitoare la cultura de celule

 

Celulele MDA-MB-231 au fost obținute de la firma American Type Culture Collection (Rockville, MD) și au fost menținute într-un mediu F-12 suplimentat cu 10% FBS. Testul colorației violet: celulele, crescând, au fost plasate în plăci de cultură cu 96 de godeuri la o densitate de 5×10⁴ celule/ml. În ziua următoare, celulele au fost expuse la doze titrate de DCA suspendat în mediul proaspăt crescut de la 80 mM la 2,5 mM cu 20% (normoxie) sau 1% O₂ (hipoxie). Celulele netratate din mediul de cultură au fost considerate drept grupul de control negativ. După 24 de ore de tratament, celulele au fost fixate cu 0,025% gluteraldehidă și apoi au fost colorate cu 0,1% violet. Celulele colorate au fost spălate cu apă și apoi au fost resuspendate în acid acetic 10%. Absorbția a fost măsurată la 590 nm, folosind un aparat Victor3^TM (PerkinElmer, Waltham, MA). Măsurătorile producției de acid lactic: Celulele crescute în plăci de cultură cu 24 de godeuri au fost spălate o dată cu soluție salină tampon cu fosfat și apoi au fost cultivate cu 100 µL RPMI fără ser în 10 mM glucoză D-(+) timpul de incubație fiind de o ora la 37°C într-o atmosferă umidificată, cu 5% CO₂, 20% sau 1% O₂. Nivelurile de acid lactic au fost măsurate folosind un reactiv enzimatic special pentru detectarea acidului lactic (Sigma). 10 µL de acid lactic au fost amestecați cu 90 µL de reactiv pentru detecția acidului lactic într-o placă cu 96 de godeuri. Amestecurile au fost incubate 5 minute în întuneric, la temperatura mediului ambiant. Absorbția în țesutul colorimetric a fost măsurată la 450 nm. Ratele de producție de acid lactic au fost calculate cu ajutorul unei curbe standard și au fost exprimate în nmol/min/mg proteină. Proteinele celulare au fost obținute prin descompunerea celulelor cu 100 µL de 0,1 N NaOH timp de 1 minut, neutralizând apoi produsul obținut cu un volum egal de 0,1 N HCl. Concentrația de proteine a fost determinată folosind un test Bradford (Pierce, Rockford, IL). Absorbția în testul colorimetric a fost măsurată la 630 nm.

 

Date statistice

 

Estimările statistice au fost făcute folosind programul GraphPad Prism, versiunea 4.03 pentru Windows (GraphPad Software, San Diego CA). Au fost făcute două teste pentru a determina dacă au fost diferențe semnificative între grupurile tratate și netratate. Analizele categoriale au fost efectuate cu ajutorul unui test bilateral Fischer Exact. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic. Valorile numerice sunt reprezentate ca valoare medie ± SEM.

 

Rezultate

 

Administrarea orală pe termen lung a DB nu are efecte sistemice adverse

 

Studiile anterioare au relevat faptul că administrarea pe cale orală și pe termen lung a bicarbonatului de sodiu conduce la creșterea semnificativă a pH-ului urinei la cobaii cu tumoră, de aproximativ 1,4 ori pe o perioadă de 21 de zile. Aceasta este o consecință a prezenței în exces a bicarbonatului și ridică probleme referitoare la siguranța administrării îndelungate în cazul omului. Pe de altă parte, pH-ul urinei în cazul cobailor tratați cu DCA a fost același cu acela măsurat la cobaii netratați. În ceea ce privește cobaii tratați cu DB, pH-ul urinei a fost același cu acela al cobailor tratați cu bicarbonat. În studiul de după supraviețuire nu au fost schimbări semnificative din punct de vedere statistic în ceea ce privește pH-ul serului în cazul grupelor studiate. O diferență marginală, dar semnificativă în ceea ce privește pH-ul serului, (p <0,03) a fost observată între cobaii tratați cu DB și cei tratați cu DCA.

 

 

 

Creșterea tumorii primare a fost neafectată de tratamente

 

Studiile precedente au arătat că administrarea orală de DCA poate încetini rata creșterii tumorii in vivo. În studiul nostru, tratamentul cu DCA și DB al cobailor cu tumoră MDA-MB-231 nu a avut niciun impact asupra creșterii tumorei primare. Astfel, tumorile din cadrul tuturor grupurilor au crescut cu o rată egală înainte de a fi extirpate. Ratele de creștere a tumorilor primare în cazul grupurilor tratate cu bicarbonat de sodiu și DB au fost în acord cu descoperirile anterioare făcute în ceea ce privește cobaii tratați cu bicarbonat. Rezultatele confirmă că neutralizarea acidității tumorale cu bicarbonat de sodiu nu inhibă creșterea tumorii primare. În cazul animalelor la care tumorile primare au recidivat după extirpare, ratele de creștere nu au fost diferite din punct de vedere statistic între grupuri. După extirpare, majoritatea tumorilor primare au recidivat în cazul cobailor tratați cu DCA. În cazul cobailor tratați cu bicarbonat și DB, mai puțin de jumătate dintre tumori au crescut din nou după extirpare. Recidivarea tumorii primare nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic atunci când s-au comparat cobaii din grupurile tratate cu grupul de cobai netratați, dar grupurile netratate sau tratate cu DCA au avut o rată de recidivare a tumorii semnificativ mai mare după extirparea chirurgicală decât grupurile tratate cu bicarbonat (bicarbonat și DB) (p<0,05).

 

Administrarea orală a bicarbonatului și a DCA-bicarbonat sporește rata de supraviețuire față de cobaii tratați doar cu DCA sau cei netratați.

 

Datorită faptului că studiul nostru a presupus administrarea pe o perioadă de peste 17 săptămâni a DCA, concentrația substanței active în apa de băut a fost limitată la 5 mM (0,75 g/L) pentru a înlătura pericolul unei carcinogeneze la nivel hepatic. Tratamentele au început la 6 zile după inocularea tumorii și au continuat până la sfârșitul studiului. Cobaii au fost tratați chirurgical atunci când tumorile au atins dimensiunea de aproximativ 490 mm³ (± 95). În medie, aceste intervenții chirurgicale au survenit în ziua a 37-a (± 8). Cobaii care au murit datorită intervenției chirurgicale au fost omiși din studiu. Cobaii au fost menținuți cu ajutorul tratamentului specific fiecărui grup până când starea agravată a tumorii a impus eutanasierea animalelor. Apoi, cobaii au fost analizați pentru a evalua și a măsura metastazele tumorale. În toate grupurile au avut loc și morți spontane. În unele dintre aceste cazuri de moarte spontană (unul din grupul netratat, două din grupul tratat cu bicarbonat, două în grupul tratat cu DCA și unul în grupul tratat cu DB) nu a fost posibilă obținerea unei analize complete postmortem. Studiul de supraviețuire a fost încheiat în a 120-a zi, punct în care cobaii care au supraviețuit dincolo de această perioadă au fost eutanasiați pentru analiza de după studiul întreprins. Astfel, cobaii tratați cu bicarbonat (p=0,03) și DB (p=0,01) au avut o rată de supraviețuire semnificativ mai ridicată decât cobaii netratați sau tratați cu DCA (p=0,02). Trei din cei 15 cobai netratați au supraviețuit după ziua a 120-a. În grupul de cobai tratați cu bicarbonat, 8 din 14 cobai au rămas în viață după a 120-a zi. În cazul grupului de cobai tratați cu DCA, 6 cobai din 15 au rămas în viață dupa ziua a 120-a. În cazul grupului de cobai tratați cu DB, 10 din 15 cobai au rămas în viață după a 120-a zi. Media de supraviețuire a fost de 100, 110, 104 și 112 zile pentru cobaii netratați, respectiv, tratați cu bicarbonat, cu DCA și cu DB.

 

 

 

Analiza metastazelor

 

În cazul tuturor grupurilor au fost observate metastaze la nivelul intestinelor, mezenterului, la nivelul ganglionilor limfatici și la nivelul plămânilor. Toți cobaii tratați au prezentat metastaze la nivel intestinal, mezenteric sau la nivelul ganglionilor limfatici într-o cantitate mai mică sau egală, comparativ cu grupul netratat, dar nicio diferență nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic. Metastazele au fost prezente atât la cobaii unde tumorile primare au recidivat după rezecția tumorii, cât și la cobaii unde tumorile primare nu au recidivat. În general, a existat o legătură semnificativă între recidivarea tumorii și dezvoltarea metastazelor (p=0,028). Pe de altă parte, nu a fost nicio corelație semnificativă din punct de vedere statistic între metastaze și cobaii care nu au prezentat recidivarea tumorii primare. În plus, nu a existat nicio corelație pozitivă între supraviețuirea peste cea de a 120-a zi și prezența metastazelor.

 

 

 

Majoritatea (11 din 14) cobailor netratați au dezvoltat metastaze pulmonare. Metastazele la plămâni au fost descoperite doar la 1 din 11 animale tratate cu bicarbonat. Metastazele pulmonare au fost descoperite în 6 din 13 animale tratate cu DCA și în 9 din 15 animale tratate cu DB. Dimensiunile medii ale leziunilor pulmonare la cobaii tratați cu DB au fost semnificativ mai reduse decât cele ale leziunilor din cazul celorlalte grupuri (p<0,001). Aria totală a leziunilor pulmonare în cazul animalelor tratate cu DB a fost mai puțin de jumătate din aria totală a leziunilor prezente în cadrul celorlalte grupuri. Aria medie a leziunii pulmonare în cazul unui cobai tratat cu bicarbonat a fost semnificativ mai mare decât leziunile măsurate la nivelul plămânilor cobailor netratați (p<0,023). Dimensiunile leziunilor pulmonare nu corespund cu momentul morții animalelor.

 

Testele de citotoxicitate și de producție a acidului lactic sugerează scăderea eficienței anticancerigene a DCA în cazul tumorilor hipoxice.

 

Monoterapia cu DCA în cazul cobailor cu tumori MDA-MB-231 nu a produs niciun efect măsurabil împotriva tumorilor sau metastazelor. Deși studiile precedente, prin care s-au testat influența dozelor mai scăzute de DCA asupra creșterii tumorale in vivo au fost eficace folosind alte linii de celule, tumorile din cazul acestui studiu au fost insensibile la tratament, comparativ cu celelalte. Efectul dozelor titrate de DCA în condiții normoxice (O₂=20%) in vitro a arătat că dozele scăzute administrate în cultură de la 2,5 la 20 mM au stimulat viabilitatea celulară, fapt demonstrat de creșterea semnificativă cu 30% a numărului de celule viabile la aceste doze de DCA după 24 de ore. Celulele MDA-MB-231 au prezentat o descreștere cu 25% a viabilității la 40 mM DCA și o descreștere cu 80% a viabilității la 80 mM DCA. Viabilitatea a fost 50% la 58 ± 5 mM în condiții normoxice. Rezultate similare au fost observate după 48 de ore de incubație cu DCA.

 

 

 

Pe de altă parte, condițiile locale precum hipoxia (O₂=1%) pot influența eficiența medicamentelor în ceea ce privește celulele tumorale. Această situație a fost testată prin evaluarea efectului citotoxic al DCA asupra celulelor tumorale cultivate MDA-MB-231. Astfel, în condiție de hipoxie, dozele de DCA între 2,5 și 20 mM nu au avut niciun efect asupra viabilității celulelor MDA-MB-231. Celulele MDA-MB-231 crescute în condiții de hipoxie au fost similare celor crescute în condiții de normoxie și o doză de 40 mM DCA a redus semnificativ viabilitatea celulelor cu 25-30%, dar celulele crescute în condiții de hipoxie au fost mult mai rezistente la creșterea concentrațiilor de DCA. Astfel, în condiții de hipoxie, a fost necesară o doză de 84 ± 8 mM pentru a reduce viabilitatea celulelor la 50%.

 

 

 

Am testat abilitatea DCA de a inhiba glicoliza în condiții de normoxie și hipoxie în cazul celulelor MDA-MB-231, prin măsurarea producției de acid lactic. Astfel, toate concentrațiile de DCA de la 2,5 la 80 mM au inhibat glicoliza între 19% și 29% în cazul celulelor MDA-MB-231 cultivate în condiții de normoxie. Scăderea producției de acid lactic a fost semnificativă în cazul tuturor dozelor (p<0,05) cu excepția concentrației de 40 mM (p=0,059). Pe de altă parte, în condiții de hipoxie, DCA administrat în aceeași cantitate nu a avut niciun efect măsurabil asupra producției de lactat.

 

Discuție

 

Premisa pentru aceste experimente a fost bazată pe modelele matematice care sugerează că puterea de neutralizare pe care o are bicarbonatul asupra acidității tumorale ar putea fi sporită în condiții de siguranță prin administrarea concomitentă de DCA. Modelul matematic a indicat faptul că inhibarea producerii de protoni de către tumoră într-o cantitate relativ mică ar putea provoca reduceri substanțiale ale acidității tumorale, fără niciun alt efect secundar asupra pH-ului sanguin. Un reactiv precum DCA se potrivește acestui demers deoarece DCA poate reduce aciditatea tumorală extracelulară prin inhibarea producției de acid lactic. În plus, s-a dovedit că DCA țintește în mod selectiv celulele tumorale. Designul acestui studiu a fost de a trata modelul de cobai cu cancer la sân cât se poate de similar cu un studiu pe pacienți, prin efectuarea unui experiment de supraviețuire cu extirparea chirurgicală a tumorilor.

 

 

 

Atât prin analiza urinei, cât și prin măsurarea pH-ului serului, am avut confirmarea faptului că adăugarea pe termen lung a DCA la dozele administrate de bicarbonat nu a provocat schimbări semnificative nici în urină și nici în pH-ul serului. Astfel, pH-ul urinei și al serului provenite de la cobaii tratați cu DB a fost comparabil din punct de vedere statistic cu măsurătorile făcute în cazul grupului tratat doar cu bicarbonat. Din aceste date am concluzionat că DCA nu induce nicio perturbare sistemică care ar putea conduce la alcaloza sistemică.

 

 

 

Studiile noastre arată că niciunul dintre tratamente nu a redus creșterea tumorei primare. Rezultatele obținute prin evaluarea grupului tratat cu bicarbonat au fost în acord cu rezultatele obținute în studiile anterioare. Alte studii au arătat că DCA inhibă semnificativ ratele de creștere a tumorii in vivo. Ne-am așteptat să observăm și noi acest efect, dar am descoperit că cobaii tratați cu DCA și DB au prezentat rate de creștere a tumorei primare similare cu cele ale cobailor netratați sau tratați cu bicarbonat. Această diferență poate fi explicată prin efectul variabil al DCA asupra diferitelor linii de celule tumorale. În ceea ce privește metastazele tumorale, rezultatele noastre au fost similare cu cele dintr-un studiu unde s-a administrat 5 mM DCA pe cale orală la cobai injectați prin vena cavă cu o linie de celule de cancer metastatic la sân. Nu a fost niciun efect măsurabil la doza de 5 mM.

 

 

 

Nu se știe de ce tratamentul cu DCA nu oferă beneficiu terapeutic împotriva tumorilor la cobai, dar studiile in vitro pot fi de ajutor în explicarea rezultatelor prezentului studiu. Studiile de viabilitate în conditii normoxice demonstrează că celulele tumorale prezintă un răspuns bifazic la concentrațiile titrate de DCA. Acest fapt este cunoscut sub numele de hormesis, unde dozele scăzute pot fi agoniste și dozele ridicate sunt toxice pentru celulele canceroase. Rezultatele privitoare la viabilitatea normoxică in vitro sugerează că concentrațiile de DCA de 20 mM sau mai mici ar putea avea un efect stimulant in vivo, deși acest fapt nu a fost măsurat. Numai la concentrații care depășesc 20 mM, DCA reduce viabilitatea celulelor tumorale în condiții de normoxie. În condiții de hipoxie, concentrațiile de DCA de 20 mM sau mai scăzute nu au avut niciun efect asupra viabilității celulelor tumorale. A existat o reducere marginală, dar semnificativă, a viabilității acestor celule la concentrații de DCA mai mari decât 20 mM în condiții de hipoxie. Astfel, a fost necesară o concentrație de 80 mM de DCA pentru a reduce viabilitatea acestor celule cu 50%.

 

 

 

În cazul studiilor referitoare la producția de acid lactic, doze de DCA de 20 mM, sau mai mici, au redus semnificativ metabolismul glicolitic al celulelor MDA-MB-231 în condiții de normoxie, cu aproximativ 19%. Doze mai ridicate decât 20 mM au inhibat producția de acid lactic cu 29% în condiții de normoxie. Nicio concentrație de DCA testată nu a redus producția de acid lactic în condiții de hipoxie. Astfel, studiile in vitro sugerează că: 1) concentrațiile de DCA mai mari decât 20 mM pot avea un efect nespecific asupra celulelor MDA-MB-231 și 2) hipoxia poate fi un factor care contribuie la rezultatele studiilor in vivo.

 

 

 

Xenografturile mamare MDA-MB-231 sunt cunoscute că dezvoltă regiuni cu hipoxie datorită dezvoltării leziunilor necrotice. De asemenea, experimente nepublicate demonstrează că tumorile dezvoltă regiuni cu hipoxie (prezintă bioluminescență) îndată ce tumorile devin palpabile (între 100-200 mm³). Alte studii au arătat legătura dintre funcția DCA și hipoxie. DCA inhibă piruvat dehidrogenaza kinaza-1 (PDK1) care, la rândul ei, inhibă metabolismul celular și provoacă consumul de oxigen, rezultând un grad avansat de hipoxie.

 

 

 

Deși metastazele observate la cobaii tratați cu bicarbonat au apărut a fi în mod clar mai puține decât cele observate la cobaii tratați cu DB (în special la nivelul mezenteric și intestinal), datele sunt insuficiente pentru a concluziona că monoterapia cu bicarbonat a fost mai eficientă în reducerea răspândirii metastazelor. Impactul major asupra supraviețuirii în studiul de față l-au avut metastazele la plămâni. După cum s-a observat la nivelul grupului netratat, majoritatea (79%) animalelor au prezentat în mod evident leziuni metastatice la plămâni. Numai unul dintre animalele tratate cu bicarbonat a fost descoperit a avea metastaze pulmonare, dar au fost două (din patru) morți spontane care au avut loc în acest grup și una în grupul netratat, unde nu s-a putut face analiza plămânilor.

 

 

 

Cu toate acestea, o analiză exactă Fischer arată că incluzând morțile spontane din grupul tratat cu bicarbonat ca fiind cauzate de metastaze la plămâni (23%) și morțile din grupul netratat ca nefiind cauzate de metastaze la plămâni, frecvența metastazelor la plămâni ar fi încă semnificativ mai mică în cazul grupului de cobai tratați cu bicarbonat (p=0,02). A fost surprinzător că procentul de cobai tratați cu DB, care au prezentat metastaze pulmonare, a fost de 60% și nu a fost diferit în mod semnificativ de prezența metastazelor pulmonare la cobaii din grupul netratat, acest fapt indicând că monoterapia cu bicarbonat este o modalitate mai favorabilă de tratament, cel puțin în cazul acestui model de tumoră. Rezultatele prezentului studiu sugerează un potențial risc în tratamentul cu DB care este necesar să fie investigat în continuare în cazul altor modele de cancer.

 

 

 

Analiza leziunilor pulmonare a relvat că tratamentul cu DB a condus la metastaze cu dimensiune medie semnificativ mai redusă, comparativ cu celelalte grupuri. Diametrul mediu al leziunii pulmonare în cazul cobailor tratați cu DB nu a fost mai mare de 30% din diametrele leziunilor prezente în celelalte grupuri de tratament. Într-un studiu anterior, s-a raportat că metastazele pulmonare mai reduse au fost corelate semnificativ cu tratamentul simplu doar cu bicarbonat, dar acesta a fost un experiment de 30 zile, folosind beta-galactozidază care să exprime celulele MDA-MB-231 și diametrele medii ale tumorei au fost aproximativ 87% din diametrele leziunilor măsurate în cazul grupului netratat.

 

 

 

Comparația dimensiunilor leziunilor tumorale ale plămânilor în cazul tuturor grupurilor de studiu pare să ne sugereze că tratamentul cu DB inhibă creșterea acestor metastaze. Totuși, dat fiind prevalența plămânilor fără metastaze în cazul grupului tratat cu bicarbonat, se poate argumenta că DCA are mai degrabă un efect stimulator, în special dacă concentrațiile de O₂ sunt aproape de normoxie, și poate chiar concura cu terapia folosind bicarbonatul. Această concluzie este susținută de rezultatele in vitro care arată că concentrațiile mai scăzute de DCA cresc viabilitatea celulelor în condiții de normoxie.

 

 

 

Creșterea ratei de supraviețuire a fost un rezultat semnificativ în cazul tuturor grupurilor tratate cu bicarbonat. În cazul cobailor tratați cu DCA se pare că a fost un efect terapeutic foarte vag, acest aspect sugerând că bicarbonatul a fost o componenta de bază în studiul de supraviețuire. Rezultatele sunt în acord cu descoperirile anterioare, dar mecanismele nu sunt bine înțelese. Mai mult de jumătate din tumorile primare în cazul cobailor tratați cu bicarbonat și cu DB nu au recidivat după extirparea chirurgicală. Frecvența scăzută a recidivării tumorilor primare o punem în legătură cu ratele crescute de supraviețuire din aceste grupuri. Diferența între grupurile tratate cu bicarbonat (bicarbonat și DB) și grupurile tratate fără bicarbonat (netratate și tratate cu DCA) în ceea ce privește recidivarea tumorii după îndepărtarea chirurgicală este semnificativă din punct de vedere statistic (p< 0,05). Este posibil ca administrarea sistematică de bicarbonat să potențeze procesul vindecării leziunilor după îndepărtarea chirurgicală a regiunii tumorale. Rolul ionilor de bicarbonat (HCO₃^–) în reparația leziunilor a fost raportată într-un studiu care investiga reparația mucoasei gastrice în cazul pisicilor cărora li s-a administrat sistematic bicarbonat de sodiu. S-a tras concluzia că excesul sistemic al ionilor de bicarbonat HCO₃^–  a facilitat reparația mucoasei superficiale. Mecanismele moleculare care conduc la acest efect sunt necunoscute, dar alte rapoarte au arătat că blocarea co-transportului Na⁺-HCO₃^– (NBC) cu ajutorul izotiocianatului (ITC) inhibă reconstrucția epitelială, procesul migrării epiteliale implicat în vindecarea leziunilor. În plus, migrația celulelor în timpul reconstrucției este dependentă de glicoliză în ceea ce privește energia. Acest lucru este notabil deoarece NBC cooperează funcțional cu transportatorul lactatului monocarboxilat (MCT-1), o enzimă asociată cu glicoliza. Ionii extracelulari de HCO₃^– cresc activitatea NBC, care, la rândul ei, sporește activitatea MCT, fapt ce conduce la o creștere a pH-ului intracelular, o condiție fiziologică favorabilă metabolismului glucozei. Se crede că controlul asupra activității glicolitice a celulelor tumorale oferă un avantaj față de restul celulelor gazdă din jur. Procesul de vindecare a leziunilor epiteliale după rezecția chirurgicală a tumorii în conjuncție cu o creștere a bicarbonatului extracelular poate îmbunătăți starea celulelor gazdă din microclimatul tumoral și conduce la evitarea profilactică a recidivării tumorei primare. Deși sunt necesare mai multe dovezi pentru aceste procese, se pare că momentul optim pentru administrarea sistemică a bicarbonatului este după îndepărtarea chirurgicală a tumorei.

 

Concluzii

Acest studiu confirmă rapoartele anterioare referitoare la rolul administrării bicarbonatului în inhibarea răspândirii metastazelor, plecând de la tumorile primare, dar subliniază, totodată, limitările acestei abordări. În timp ce în cazul altor studii DCA s-a dovedit a fi atât sigură, cât și eficientă împotriva celulelor tumorale, rezultatele prezentului studiu sunt în acord cu investigațiile cele mai recente care atenționează asupra potențialelor capcane în utilizarea DCA. Mai întâi, DCA nu este universal eficient împotriva tuturor tipurilor de celule canceroase. În al doilea rând, hipoxia de la nivelul tumorii joacă rolul unui factor microclimatic ce scade eficiența DCA. Așadar, efectul impredictibil al DCA împotriva tumorilor atrage atenția asupra utilizării sale ca agent terapeutic, până când studiile ulterioare vor putea determina rolul molecular al DCA în cazul diferitelor microclimate tumorale.