Jee Eun Kim¹, Jae Seung Kang²* and Wang Jae Lee²*

¹Department of Anatomy, Chung-Ang University College of Medicine, Seoul 156-756, ²Department of Anatomy, Seoul National University

College of Medicine, Seoul 110-799, Korea

Se știe că vitamina C joacă un rol important în tratamentul și în prevenirea cancerului, dar, totuși, mecanismele sale specifice de acțiune sunt în mare parte încă necunoscute. În prezent, incidența cancerului de colon crește în Korea. În acest studiu a fost examinat efectul vitaminei C asupra fenomenului de inducție a apoptozei în cazul cancerului de colon, precum și mecanismele implicate în acest proces. Astfel, în urma tratamentului cu vitamina C am remarcat o creștere semnificativă a apoptozei și a influxului de calciu la nivelul reticulului endoplasmatic (ER) în ceea ce privește linia de celule de cancer de colon la om, HCT-8. Totuși, apoptoza indusă cu ajutorul vitaminei C a fost efectiv inhibată în cazul tratamentului anterior cu BAPTA-AM (1,2-bis(o-aminophenoxy) ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid) care este bine cunoscut ca fiind un agent de chelare specifică a calciului. În timpul apoptozei, s-a remarcat creșterea translocării Bad de la citosol la mitocondrii, după ce a fost eliberat de proteinele 14-3-3-beta. În acest proces, expresia Bax, o bine cunoscută proteină pro-apoptotică, a fost de asemenea crescută. Punând rezultatele cap la cap, vitamina C induce apoptoza în cazul liniei de celule din cancerul de colon HCT-8 prin creșterea:

1)      influxului de calciu la nivelul reticulului endoplasmatic (ER);

2)      translocarii Bad catre mitocondrii;

3)      expresiei Bax.

[Immune Network 2012;12(5):189-195]

Introducere

Deși vitamina C este un bine cunoscut antioxidant, precum și un nutrient esențial, există numeroase mărturii care atestă efectele sale antitumorale. Ea induce apoptoza prin perturbarea potențialului membranei mitocondriale și prin suprimarea translocării receptorului de transfer de la citosol la membrană. În plus, vitamina C suprimă proliferarea celulelor canceroase prin oprirea creșterii acestora în stadiul G1 care se află în strânsă legătură cu modularea activității inhibitorului de protează p53-p21Waf1/Cip1 și a CDK2. De asemenea, prin tratamentul cu vitamina C este scazută producția factorilor care sunt implicați în metastaze. Cancerul de colon a devenit una dintre formele cele mai frecvente de cancer în țările vestice, precum și în Asia de Nord-Est, inclusiv în Korea. Pentru a preveni reapariția cancerului de colon s-au folosit substanțe chimioterapeutice precum 5-fluorouracil oxaliplatin, leucovorin și irinotecan. Se știe că anumite medicamente nesteroidiene anti-inflamatoare, incluzând sulindac-ul și aspirina, sunt destul de eficiente ca medicamente chimice de prevenire, dar efectele secundare ale acestora nu sunt încă bine identificate. Privită din această perspectivă, vitamina C este una dintre cele mai bune substanțe, care acționează nu numai ca un agent chimic cu rol preventiv, ci și ca un agent terapeutic împotriva cancerului de colon.

Este cunoscut faptul că sunt două tipuri de apoptoză; primul tip depinde de moartea receptorului chimic, aici fiind vorba de calea exterioară, și al doilea tip de apoptoză ține de calea intrinsecă, la nivel de mitocondrii, independentă de moartea receptorului chimic. Primul tip de apoptoză este inițiat de obicei de receptorul TNF sau de superfamilia sa, cum ar fi CD95. În contrast cu acest tip de apoptoză, apoptoza intrinsecă este inițiată de obicei de substanțe chimice și de proteina supresoare a tumorilor p53. În plus față de aceasta, membrii familiei Bcl-2, cum ar fi Bid, Bax și Bad sunt mediatori cheie în ceea ce privește calea intrinsecă a apoptozei. În mai multe rapoarte recente se afirmă că reticulul endoplasmatic (ER) joacă un rol important în acest tip de apoptoză. Deoarece ER este senzitiv la perturbarea nivelului de energie celulară, starea redox sau nivelul intracelular de Ca²⁺, asemenea perturbări sunt în strânsă legătură cu moartea celulei cauzată de schimbarea homeostaziei la nivelul ER. Eliberarea de calciu din ER către citosol induce apoptoza care este urmată de translocarea Bad către mitocondrii independent de activarea calcineurinei, Ca₂₊/calmodulină/serină/threonină/fosfatază. Bad este fosforilată de factori care supraviețuiesc și păstrată la nivelul citosolului ca un complex cu proteină traductoare de semnal, 14-3-3. Totuși, Bad este translocat către mitocondrii și lipit de Bcl-2 și Bcl-xL după ce a fost defosforilat și disociat de 14-3-3 de către semnalele apoptotice.

În studiul de față este prezentat un nou mecanism pentru apoptoză al vitaminei C în cazul liniei de celule de cancer de colon la om, HCT-8, prin creșterea stresului la nivelul ER și prin translocarea Bad către mitocondrii după disocierea de 14-3-3-beta.

Materiale și metode

Celule și reactivi chimici

Linia de celule de cancer de colon la om, HCT-8 a fost obținută de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celulele au fost menținute într-o fază de creștere logaritmică continuă și au fost cultivate în mediul RPMI 1640 suplimentat cu 2mM L-glutamină, 100 U/ml penicilină, 100 microgram/ml streptomicină și 10% ser fetal de bovină inactivat la temperatură înaltă (FBS).

Detectarea apoptozei

După ce celulele (2×10⁶) au fost expuse la concentrații variate de vitamina C (0,25, 0,5, 1, 2 si 4 mM) timp de 24 de ore, ele au fost colectate și spălate de două ori cu PBS rece și apoi au fost resuspendate în soluție tampon, la o concentrație de 1×10⁶ celule/ml. Apoi, celulele au fost incubate cu 5 µl de Anexina V-FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) la temperatura camerei, timp de 15 minute în întuneric. Un microlitru de 7-AAD (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) a fost adăugat înainte de analiza citometrică în flux cu FACSCaliber (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).

Analiza concentrațiilor de calciu intracelular

Celulele (2×10⁶) au fost incubate în prezența sau absența a 2mM de vitamina C timp de 0,5, 1 și 2 ore în RPMI conținând 1% ser fetal de bovină. Suspensia de celule izolate (1×10⁶) a fost tratată cu 0,5 µM Fluo-3/AM (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) în 200µl de mediu RPMI fără ser, timp de 30 de minute la 37°C. Apoi, celulele au fost spălate de două ori cu o soluție fără ser și resuspendate. Mostrele au fost analizate cu ajutorul citometriei în flux (excitație: 485nm, emisie: 538nm) pentru a se observa creșterea în emisia fluorescentă a substanței Fluo-3, fluorescență dependentă de ionii de Ca²⁺.

Separarea proteinelor mitocondriale

Celulele (2×10⁶) au fost expuse la 2mM vitamina C timp de 3, 6 și 9 ore și apoi fracțiunile mitocondriale au fost preparate cu ajutorul kit-ului Mitochondria Isolation, urmând instrucțiunile producătorului (Pierce, Rockford, IL, SUA). Fracțiunile mitocondriale au fost purificate prin centrifugare și stocate la -4°C pentru analizarea ulterioară prin immunoblotting pentru a investiga translocarea Bad din citosol către mitocondrii.

Analiza vestică a sugativei

Celulele au fost fragmentate și s-au extras proteinele într-o soluție tampon cu 50mM Tris-HCl (pH 7,4), 1% NP-40, 0,25% deoxicolat de sodiu, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM NaF, 1mM ortovanadat de sodiu, 1mM fluorură de fenilmetilsulfonil și un amestec pentru inhibarea proteazei. Concentrația de proteine a fost măsurată folosind  kit-ul Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SUA). Cantități egale de proteine (30?80microgram) au fost redizolvate în gel SDS cu 12% poliacrilamidă și au fost transferate pe membrane de nitroceluloză. Aceste membrane au fost blocate cu 5% lapte degresat și 0,1% soluție salină de fosfat (PBS) timp de o oră, spălate și apoi expuse anticorpilor peste noapte la 4°C. Anti-Bax și 14-3-3-delta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA); anti-14-3-3-beta și anti-Bad (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, SUA); anti-Citocrom (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) au fost diluate 1:200?1000 în 0,1% Tween 20-PBS. După spălare, membranele au fost expuse anticorpilor secundari conjugați cu biotină (1:5000) timp de o oră la temperatura camerei. Apoi, membranele au fost spălate, incubate cu o soluție de 1:5000 streptavidină și peroxidază din hrean; proteinele imunoreactive au fost vizualizate cu sistemul de detecție ECL (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, SUA).

Rezultate

Inducția apoptozei la nivelul celulelor HCT-8 prin tratamentul cu vitamina C

Având în vedere rapoartele precedente care afirmă că o concentrație relativ mare de vitamina C a indus apoptoza la nivelul celulelor tumorale, în prezentul studiu s-a investigat dacă vitamina C poate să inducă, de asemenea, apoptoza la nivelul liniei de celule de cancer de colon la om, HCT-8. După cum este prezentat în fig. 1A, s-a descoperit că apoptoza masivă a fost indusă de către tratamentul cu 2mM de vitamina C timp de 24 de ore și apoptoza a fost prezentată la 12 ore după tratamentul cu vitamina C (fig. 1B).

Fig.1 Studiul kinetic legat de doză și timp al vitaminei C pentru inducția apoptozei în cazul linei de celule de cancer de colon la om, HCT-8. (A) Celulele (2 x 10⁶) au fost incubate în prezența a 2 și 4 mM de vitamina C timp de 24 de ore. (B) Celulele (2 x 10⁶) au fost incubate în prezența a 2mM de vitamina C și incubate timp de 12, 18 și 24 de ore. Apoi celulele au fost colectate și a fost măsurat efectul vitaminei C asupra inducției apoptozei cu ajutorul colorării cu Annexin V-FITC/7-AAD. Rezultatul este reprezentativ pentru cele trei experimente.

Creșterea concentrației de calciu citosolic prin stresul ER provocat prin tratamentul cu vitamina C

Sunt mai multe rapoarte care afirmă că creșterea permeabilității membranei reticulului endoplasmatic (ER) și eliberarea de calciu din ER sunt în legătură cu inducția apoptozei la nivelul tumorii. Prin urmare, nivelul de calciu citosolic a fost examinat pentru a clarifica dacă inducția apoptozei la nivelul celulelor HCT-8 prin tratamentul cu vitamina C este legat, de asemenea, de schimbarea alterării la nivelul ER. După cum a fost de așteptat, nivelurile de calciu citosolic în cazul celulelor HCT-8 tratate cu vitamina C au crescut la 30 de minute după administrarea vitaminei C și au atins un maxim la 2 ore dupa tratamentul cu vitamina C (fig. 2A). Pentru a verifica dacă creșterea nivelului de calciu în citosolul din ER este în legătură cu apoptoza celulelor HCT-8 provocată de vitamina C, celulele au fost tratate mai întâi cu BAPTA-AM (1,2-bis (o-aminophenoxy) ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid) timp de 30 de minute înainte de tratamentul cu vitamina C. S-a descoperit faptul că apoptoza la nivelul celulelor HCT-8, produsă de 2mM de vitamina C a fost efectiv suprimată (fig. 2B).

Fig. 2 Apoptoza celulelor HCT-8 prin creșterea nivelului de calciu intracelular prin tratamentul cu vitamina C. (A) Celulele (1 X 10⁶) au fost incubate în absența sau prezența a 2mM de vitamina C timp de 0,5, 1 și 2 ore și apoi au fost tratate cu 0,5uM Fluo-3/AM la 37°C. Fiecare mostră a fost analizată pentru detectarea nivelelor de calciu citosolic prin schimbarea fluorescenței coloranților utilizând filtrele standard pentru o excitație de 488nm. (B) Celulele au fost preincubate timp de 30 minute cu (B) BAPTA-AM (1,25uM), înainte de tratament cu 2mM de vitamina C timp de 24 de ore. Și apoi celulele au fost colectate și efectul vitaminei C asupra inducției apoptozei a fost măsurat cu ajutorul colorantului Annexin V-FITC/7-AAD. Rezultatul este reprezentativ pentru cele trei experimente. Datele prezentate ca medie±SD.

Creșterea expresiei Bax și disocierea Bad de 14-3-3-beta prin tratamentul cu vitamina C

Deoarece s-a dovedit deja că vitamina C a indus efectiv apoptoza la nivelul celulelor HCT-8 și că acest proces este în strânsă legătură cu stresul asupra ER, a fost investigată schimbarea expresiei Bax, membru al familiei pro-apoptotice Bcl-2. În plus, a fost investigată disocierea Bad de 14-3-3-beta care este afectată de stresul asupra ER. Expresia Bax a fost remarcabil crescută la 6 ore după tratamentul cu vitamina C (fig. 3A). În acelasi timp, expresia Bad a fost, de asemenea, crescută, dar nu a fost remarcată nicio schimbare semnificativă în ceea ce privește expresia 14-3-3-beta și 14-3-3-delta, două proteine majore din clasa proteinelor 14-3-3 (fig. 3B). Creșterea nivelului de calciu citosolic eliberat din ER este responsabilă pentru disocierea Bad de 14-3-3. Așadar, au fost examinate cantitățile de Bad care este legat cu 14-3-3-beta în citosol după tratamentul cu vitamina C, după imunoprecipitarea cu anti-anticorp 14-3-3-beta. Este interesant faptul că cantitatea de Bad asociat cu 14-3-3-beta în citosol era scazută la 6 ore după tratamentul cu vitamina C (fig. 3C).

Fig. 3 Creșterea expresiei Bax și disocierea expresiei Bad de 14-3-3beta prin tratamentul cu vitamina C. (A și B) Celulele (2 x 10⁶) au fost incubate timp de 3, 6, 9 și 12 ore în prezența sau absența a 2mM de vitamina C. Apoi proteinele au fost extrase și supuse unei analize a proteinelor individuale (immunoblotting) efectuată utilizând (A) anticorpi anti-Bax și (B) anticorpi anti-Bad, anticorpi anti-14-3-3beta, și anticorpi anti-14-3-3 sigma, după cum a fost prezentat în secțiunea materiale și metode. Rezultatul este reprezentativ pentru mai mult decât cele trei experimente. (C) După ce celulele au fost cultivate în prezența sau absența a 2mM de vitamina C timp de 0,5, 1, 3 și 6 ore, au fost extrase proteinele și supuse imunoprecipitării cu un anticorp monoclonal împotriva 14-3-3beta. Proteinele imunoprecipitate au fost utilizate pentru detectarea Bad asociată prin analiza immunoblotting. Pata a fost ștearsă și s-a refăcut testul cu anticorpul anti 14-3-3beta, după cum este descris în materiale și metode. Rezultatul este reprezentativ pentru mai mult decât cele trei experimente. Densitatea fiecărei benzi a fost măsurată cu ajutorul densitometriei și valorile au fost exprimate ca raport Bad/14-3-3beta.

Translocarea Bad din citosol către mitocondrii prin tratamentul cu vitamina C

Pentru a investiga dacă Bad disociat de 14-3-3-beta este translocat în mitocondrii, a fost examinată localizarea Bad în itocondrii prin immunoblotting după separarea fracțiunii de proteine mitocondriale din HCT-8 în prezența vitaminei C. După cum s-a așteptat, cantitatea relativă de Bad crescuse la nivelul fracțiunii mitocondriale, proporțional cu timpul tratamentului cu vitamina C (fig 4A). Immunoblotting împotriva citocromului c a fost realizat pentru a distinge fracțiunea mitocondrială de fracțiunea citosolică. Cantitatea de Bad de la nivelul mitocondriilor în cazul tratamentului cu vitamina C a fost prezentat ca raport relativ între Bad și citocromul C (fig. 4B).

Fig. 4 Translocarea Bad din 14-3-3beta către mitocondrii prin tratamentul cu vitamina C. (A) Celulele (2 x 10⁶) au fost incubate timp de 3, 6 și 9 ore în prezența sau absența a 2mM de vitamina C. Fracția mitocondrială a fost preparată după cum este descris în materiale și metode. Analiza immunoblotting a fost făcută prin utilizarea anticorpilor împotriva Bad și citocromului C. (B) Densitatea fiecărei benzi a fost măsurată prin densitometrie și valorile au fost exprimate ca raport Bad/citocrom C.

Discuție

Majoritatea mamiferelor pot sintetiza vitamina C prin conversia glucozei în ascorbat la nivelul ficatului prin L-gluono-gama-lactona-oxidaza (Gulo). Totusi, omul și câteva primate nu pot sintetiza vitamina C datorită mutației la nivelul genei care codifică L-gluono-gama-lactona-oxidaza. S-a dovedit că vitamina C are influențe biomedicale variate, fiind antiinflamatoare, imunomodulatoare și antioxidantă la nivelul sistemului imunitar și la nivelul sistemului nervos central. În tratamentul pacienților bolnavi de cancer se presupune că vitamina C are un mare rol în reducerea efectelor secundare provocate de chimioterapie, precum și în creșterea eficienței terapeutice a substanțelor chimice administrate. S-a raportat faptul că vitamina C previne proliferarea și metastazele provocate de celulele canceroase. Mai mult, vitamina C poate induce apoptoza la nivelul celulelor canceroase prin perturbarea potențialului membranei mitocondriale. Este binecunoscut faptul că mitocondriile și ER sunt organite intracelulare importante în timpul procesului de apoptoză intrinsecă, independentă de receptorul TNF, dar și mecanisme specifice de acțiune ale vitaminei C în inducerea apoptozei prin modularea funcției ER.

Bax joacă un rol important în inducerea apoptozei prin eliberarea citocromului C din mitocondrii. Pe lângă Bax, sunt implicate în acest proces mai multe tipuri de proteine din familia Bcl-2, cum ar fi Bid și Bad. Bid este un mediator în procesul de apoptoză extrinsecă, dependentă de receptorul TNF, dar Bad acționează în cazul apoptozei intrinseci, independentă de receptorul TNF, după disocierea de proteina 14-3-3. După cum este prezentat în fig. 3A, expresia Bad a fost crescută prin tratamentul cu vitamina C, chiar și fără stimularea receptorilor TNF ai celulelor HCT-8. Așadar, trebuie investigate în continuare mecanismele care conduc la creșterea expresiei Bax prin tratamentul cu vitamina C. S-a descoperit, de asemenea, că disocierea remarcabilă a Bad de 14-3-3-beta are loc cu ajutorul vitaminei C (fig. 3B). Așa cum s-a descris anterior, perturbarea potențialului mitocondrial fără activarea cu enzima caspaza-8 este o cale majoră pentru inducția apoptozei la nivelul linei de celule de melanom,  B16F10. Prin urmare, se pare că Bad disociat de 14-3-3-beta este un mediator cheie în ceea ce privește apoptoza indusă cu ajutorul vitaminei C prin perturbarea potențialului membranei mitocondriale.

Este cunoscut faptul că stresul efectuat asupra reticulului endoplasmatic (ER) prin modificarea concentrației de calciu sau a stării redox induce apoptoza. Eliberarea ionilor de Ca²⁺ din ER este un eveniment important pentru disocierea Bad de 14-3-3-beta. Așa cum este prezentat în fig. 2A, concentrația citosolică de Ca²⁺este crescută prin tratamentul cu vitamina C. S-a văzut că agentul chelator specific pentru ionii Ca²⁺, BAPT-AM, a inhibat efectiv apoptoza indusă cu ajutorul vitaminei C (fig. 2B). Așadar, eliberarea de ioni Ca²⁺din ER în citosol la nivelul celulelor HCT-8 este primul pas în apoptoza provocată prin tratamentul cu vitamina C. Cu alte cuvinte, vitamina C induce efectiv apoptoza în cazul liniei de celule de cancer de colon la om, HCT-8, prin influxul de calciu la nivelul ER. ?i, acest proces este urmat de translocarea Bad către mitocondrii după disocierea de 14-3-3-beta. În cele din urmă, se pare că Bad translocat este implicat în apoptoză după heterodimerizarea cu proteinele Bcl-2 sau Bcl-xL pentru a promova apoptoza dependentă de mitocondrii.

Linia de celule de cancer de colon HCT-8 este rezistentă la substanțe chimioterapeutice cum ar fi 5-fluorouracil și cisplatin. Totuși, în studiul de față s-a arătat că vitamina C este eficientă în inducția apoptozei la nivelul celulelor HCT-8 (fig. 1). Astfel, vitamina C se dovedește a fi un adjuvant util pentru tratamentul cancerului de colon cu substanțe chimioterapeutice. Efectul sinergic sau aditiv al tratamentului combinat, folosind substanțe chimioterapeutice și vitamina C, este acum în faza de investigare.

/p